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Production améliorée, récupération et application d'une protéase alcaline produite en utilisant les boues d'épuration comme substrat.

Bezawada, Jyothi (2010). Production améliorée, récupération et application d'une protéase alcaline produite en utilisant les boues d'épuration comme substrat. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 271 p.

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Résumé

La demande pour les protéases alcalines a augmenté de par leur utilisation dans les domaines des détergents, de l’industrie alimentaire et pharmaceutique. Les espèces de Bacillus sp. sont considérées comme de prolifiques producteurs de protéases alcalines, largement employées dans l’industrie des détergents. L’emploi d’enzyme dans les détergents devrait s’accroitre, puisque les enzymes permettent d’augmenter le pouvoir détachant des détergents sur une large gamme de température. Au Canada, de sérieux problèmes se posent quand à la disposition des grands volumes de boues d’épuration produits annuellement. Les méthodes conventionnelles de disposition des boues (incinération, épandage et enfouissement) entraînent la prolifération de pathogènes et la production de polluants secondaires tels que les métaux lourds et les composés organiques toxiques. Ainsi, une solution alternative et souhaitable consiste à réutiliser les boues. Les biotechnologies peuvent constituer un outil intéressant pour donner une valeur ajoutée aux procédés impliqués dans le traitement et la réutilisation des eaux usées et des boues d’épuration. Il est permis de penser que la complexité des boues d’épuration pourra stimuler et augmenter la production de protéases aux propriétés intéressantes. La réutilisation des boues à des fins de production de protéases pourra contribuer à en diminuer la quantité à gérer, et les protéases produites pourront remplacer les produits chimiques employés dans de nombreuses industries. Les protéases sont parmi les enzymes les plus employées en industrie, leur vente comptant pour 60% de toutes les ventes d’enzymes au niveau mondial. De celles-ci, les protéases alcalines sont employées principalement comme additifs dans les formulations de détergents. Les protéases d’origine bactérienne sont les plus employées, en comparaison avec les protéases fongiques d’origine végétale. Idéalement, les protéases utilisées dans les formulations de détergents devraient êtres hautement actives sur une large gamme de pH et de température. Il y a donc un grand intérêt au niveau industriel pour les protéases. La production de protéase par des souches de Bacillus d’intérêt a donc été étudiée de façon intensive, sur différents substrats de production, comme par exemple sur des milieux synthétiques contenant des farines de soya, des liqueurs de mais et des caséines. Le substrat de production peut représenter 40% des coûts totaux de production des enzymes. Ainsi, la production de protéases à partir de boues d’épuration municipales pourrait permettre de diminuer de façon importante les coûts de production. Cependant, l’emploi de boues d’épuration pour la production de protéases n’a pas été étudié de façon approfondie. Donc, l’objectif principal de ces travaux est d’étudier la production, la récupération et l’utilisation de protéases alcalines produites par B. licheniformis en utilisant les boues d’épuration comme substrat de production. 74 souches bactériennes ont été isolées de 10 échantillons de sols riches en protéines, comme les sols entourant les abattoirs, les sols riches en matières organiques en décomposition et des échantillons d’eaux boueuses. Tous les échantillons ont été recueillis dans les environs de la ville de Québec. Sur la base de la morphologie, de la grosseur des colonies et des caractéristiques microscopiques, les isolats ont été caractérisés en 33 types. Parmi ceux-ci, 5 isolats ont démontré une bonne activité protéolytique (>5), 8 isolats une activité protéolytique modérée (entre 3 et 5), 12 isolats une faible activité (entre 2 et 3) et 8 isolats une très faible activité (inférieure à 2). Les cinq souches les plus prometteuses selon le précédent classement ont été identifiées comme étant des souches de Bacillus, selon leurs caractéristiques morphologiques et biochimiques. La production de protéases extracellulaires par différentes souches de B. licheniformis (ATCC 21415, ATCC 21417 et ATCC 21424) et par les 5 souches précédemment isolées à été évaluée en employant les boues d’épuration et un milieu synthétique comme milieu de culture. Ces essais ont été réalisés afin de comparer les capacités de production de protéases des différentes souches testées, et afin de comparer la capacité des milieux de culture à soutenir la production des enzymes. Toutes les souches sélectionnées ont démontré des niveaux d’activités presque similaires dans les deux types de milieu de culture. Les résultats de la sélection des souches ont démontré que la souche B. licheniformis ATCC 21424 a un potentiel élevé pour la production de protéases dans le milieu constitué de boues d’épuration. Ainsi, B. licheniformis ATCC 21424 a été choisi pour les études subséquentes. Ces observations ont de plus confirmé que les boues d’épuration peuvent êtres utilisées comme milieu de culture (source de nutriments) pour produire des protéases à des fins industrielles. Des boues d’épuration ont été utilisées comme milieu de culture en y ajoutant du carbone et de l’azote sous différentes formes afin d’évaluer leur potentiel de production de protéases par B. licheniformis ATCC 21424. De toutes les sources de carbone et d’azote testés, l’ajout de lactose (1,5% p/v) comme supplément de carbone et de farine de soya (1,5% p/v) comme supplément d’azote ont permis d’obtenir la production de protéases la plus élevée, en erlenmeyer tout comme en fermenteur. Finalement, la récupération des enzymes a été effectuée par technique d’ultrafiltration et le produit récupéré a été évalué selon sa capacité à détacher des tissus souillés de sang. L’optimisation des paramètres d’ultrafiltration (pression transmembranaire (TMP) et du flux d’alimentation) a été effectué avec une membrane de 10 kDa. Une TMP de 90 kPa et un flux d’alimentation de 714 L/h/m² sont les paramètres ayant permis d’obtenir le plus haut pourcentage de récupération (83%) des enzymes du surnageant des bouillons fermentés. Les protéases produites par B. licheniformis ATCC 21424 sont stables sur une large gamme de pH et de température, plus actives en présence d’ions Ca²⁺ et de Mn²⁺ et démontrent une excellente compatibilité avec les différentes préparations commerciales de détergent testées. Les protéases ont donc été utilisées comme additifs aux détergents, afin d’évaluer leur capacité à augmenter leur pouvoir détachant. L’ajout d’enzymes dans le détergent (Sunlight®) permet d’augmenter significativement le pouvoir du détergent à détacher les tâches de sang.

Abstract

The demand for alkaline proteases has been grown because of their wide spread use in detergent, leather, food, photography and in the pharmaceutical industries. Bacillus species are reported to be prolific producers of alkaline proteases which constitute a major source of enzymes used in detergents. The use of enzyme in detergents is expected to increase since the addition of enzymes compensative for to low efficiency of detergent washing at wide range of temperature. Canada poses serious disposal problems of large volume sludge produced annually. The traditional methods of sludge disposal such as incineration, land application and land filling produce secondary pollutants like pathogens, heavy metals, toxic and organic compounds. Therefore, the alternate or suitable solution is reuse of sludge in an eco-friendly approach. Biotechnology is an interesting tool to add value to the processes involved in wastewater and wastewater sludge disposal/reuse. It is expected that the complexity of sludge could stimulate/enhance the protease production and their characteristics. The reuse of wastewater sludge will help to reduce their quantity as well as the value-added products produced will replace chemical products used in industries. Proteases are one of the most important industrial enzymes accounting for nearly 60% of the total worldwide enzyme sales. Of these, alkaline proteases are employed primarily as cleansing additives. Among the various proteases, bacterial proteases are the most significant, compared to animal and fungal proteases. Ideally, proteases used in a detergent formulation should have a high level of activity over a broad range of pH and temperatures. Still there is always need for proteases with desirable properties as they have got demand in the industrial application. Alkaline proteases from high yielding Bacillus strains have been studied extensively using different substrates such as synthetic medium containing casein, complex medium containing soy flour, corn steep liquor and sodium caseinate. The raw material cost for fermentation products is about 40% of the overall production cost. Hence, production of protease from domestic wastewater sludge could drastically reduce the cost of enzyme production. However, protease production using wastewater sludge as raw material has not been explored fully. Therefore, the principal objective of this research is Enhanced production, recovery, and application of alkaline protease produced by B. licheniformis strains using wastewater sludge as raw material. Seventy four bacteria were isolated from ten protein rich soil, such as soil near slaughter house, soil rich in decaying organic matter and muddy water samples collected from Quebec City. On the basis of colony size, morphology and microscopic characteristics, the isolates were categorized into 33 types. Among these, 5 isolates showed good proteolytic activity (>5), 8 isolates showed moderate activity (between > 3 and < 5), 12 isolates showed poor activity (between >2 and < 3) and 8 isolates exhibited very poor activity (below 2). The five promising isolates were identified as Bacillus strains using morphological and biochemical characteristics. The production of extracellular protease by different Bacillus licheniformis strains (ATCC 21415, ATCC 21417 and ATCC 21424) and promising 5 isolates from screening programme was tested in wastewater sludge as a raw material as well as in synthetic medium. This was done to compare the capacity of protease production by different strains and to compare the capacity of the medium to provide nutrients for enzyme synthesis. All the selected strains showed almost similar activities in both media. Result from microbial selection indicated that B. licheniformis ATCC 21424 has high potential for protease production in terms of quantity in sludge medium. Hence B. licheniformis ATCC21424 has chosen for further study. The observation from this study confirmed that wastewater sludge could be used as a raw material (nutrient source) for these microbes to produce protease for industrial purpose. Wastewater sludge supplemented with different carbon and nitrogen sources were tested for enhanced production of protease from B. licheniformis ATCC 21424. Lactose 1.5% (w/v) as carbon source and 1.5% (w/v) soybean meal as nitrogen source has given highest protease production in both shake flask and fermentor among all carbon and nitrogen sources tested. Finally, recovery of enzyme was carried out by using ultrafiltration techniques and application study was carried out for blood stain removal. Optimization of ultrafiltration parameters (transmembrane pressure [TMP] and feed flux) were carried out with 10 kDa membrane. TMP of 90 kPa and feed flux of 714 L/h/m² gave highest recovery (83%) of the enzyme from the centrifuged supernatant. As the protease produced by B. licheniformis ATCC 21424, was stable over a wide range of pH and temperature, enhanced by metal ions Ca²⁺ and Mn²⁺ and also showed excellent compatibility with various commercial detergents tested, it was used as an additive in detergent, to check the contribution of the enzyme in improving the washing performance of the detergent. The supplementation of the enzyme preparation in detergent (Sunlight) could significantly improve the cleansing performance of the detergent towards the blood stains.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Mots-clés libres: protéase alcaline; boues d'épuration; bactérie; Bacillus licheniformis; soja synthétique; carbone; azote; production; récupération; application
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 18 juin 2013 15:54
Dernière modification: 11 nov. 2015 14:25
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/1387

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