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Enlèvement des perturbateurs endocriniens (hormones) par oxydation enzymatique, dans les eaux usées.

Auriol, Muriel (2007). Enlèvement des perturbateurs endocriniens (hormones) par oxydation enzymatique, dans les eaux usées. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 435 p.

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Résumé

La principale source des estrogènes naturels (estrone - El, l7β-estradiol - E2 et estriol -E3) dans l'environnement aquatique est via les sécrétions humaines et animales. L'estrogène synthétique l7a-éthinylestradiol (EE2) est le composé principal des pilules contraceptives, et donc sécrété essentiellement par les femmes. Une importante contribution en ces hormones stéroïdiennes correspond aux effluents des stations de traitement des eaux usées (STEPs) municipales, qui sont rejetés directement dans l'environnement aquatique. En effet, plusieurs études de toxicité ont montré que ces composés sont largement responsables des effets estrogéniques observés chez les organismes aquatiques exposés. L'objectif principal de ce projet de recherche a été de mettre en place un système de traitement innovateur et économiquement viable pour un enlèvement efficace des estrogènes naturels et synthétiques, ainsi que de leur estrogénicité associée, des effluents des STEPs municipales. Le choix du procédé s'est porté sur l'oxydation enzymatique des estrogènes par l'enzyme peroxydase de raifort (HRP) et l'enzyme polyphénolique laccase. La HRP a été sélectionnée comme enzyme de référence car c'est une enzyme très étudiée et efficace pour le traitement de composés phénoliques. La laccase a été choisie comme enzyme pouvant être produite à faible coût, par l'utilisation de biosolides comme substrat de croissance. Plusieurs expériences dans des réacteurs en batch ont été réalisées en laboratoire pour développer et optimiser le procédé enzymatique considéré, et évaluer l'efficacité de ce procédé de traitement pour l'enlèvement des estrogènes (E1, E2, E3 et EE2) présents dans les eaux usées municipales. Les concentrations en estrogènes ont été déterminées par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrométrie de masse (LC-MS). Les tests sur l'activité estrogénique après traitement enzymatique ont été effectués par le bio essai in vitro aux levures recombinantes (RYA). Les expériences réalisées en eau synthétique ont indiqué que le pH optimum pour l'enlèvement de chaque estrogène était aux alentours de 6 pour la laccase et de 7 pour la HRP. La HRP permettait d'atteindre des taux d'enlèvement relativement élevés sur une large gamme de pHs (6-8). La laccase semblait, par contre, être fortement dépendante du pH. Cependant, les deux enzymes présentaient un pH optimal compris dans l'intervalle des pHs retrouvés dans les STEPs municipales. Le procédé par la HRP requière l'apport de H₂O₂ pour être activée et pouvoir oxyder les estrogènes. En eau synthétique et à des concentrations initiales en estrogènes de l'ordre du µg/L, le rapport molaire dioxyde/substrat optimal, à pH 7.0 et 25±1 ℃, correspondait approximativement au rapport stoichiométrique théorique, soit 0.5. L'étude cinétique réalisée afin de déterminer l'affinité de chaque enzyme (HRP et laccase) envers chacun des substrats étudiés (E1, E2, E3 et EE2) et d'évaluer l'efficacité catalytique de ces enzymes a indiqué que l'oxydation par la HRP et la laccase des estrogènes étudiés correspondait à une réaction du pseudo premier ordre et suivait le modèle cinétique de Michaelis-Menten. Les expériences ont été menées en laboratoire dans une eau synthétique à pH 7.0 et 25±1 ℃ pour des concentrations initiales en estrogènes de l'ordre du µg/L. De plus, en se basant sur le modèle de Michealis-Menten, les résultats expérimentaux ont montré que les deux enzymes présentent une même affinité pour les estrogènes étudiés sous les conditions expérimentales utilisées. Des valeurs de KM entre 1.32-7.47 µM ont été relevées pour la HRP et la laccase. Par ailleurs, les valeurs du rapport kcat/KM ont indiquées que le procédé de traitement par la HRP semblait plus efficace que le procédé de traitement par la laccase, pour l'enlèvement des estrogènes étudiés dans une eau synthétique. Plusieurs expériences ont également été réalisées dans une eau usée municipale (STEP de Rolla, Missouri, US). Basés sur les résultats expérimentaux, en 1 heure de traitement et à 25± 1 °C, un enlèvement complet des 4 estrogènes étudiés (concentrations initiales de l'ordre du ng/L) de l'eau usée a été atteint avec 10 U/mL de HRP à pH 8.0 et avec 20 U/mL de laccase à pH 7.0. De plus, les tests ont aussi montré que l'enzyme HRP a été fortement affectée par les constituants présents dans l'eau usée. Par contre, l'enzyme laccase ne semblait pas être affectée par ces constituants. Dans un traitement enzymatique, le coût associé à l'enzyme représente la plus grosse part de l'investissement. Ce coût peut être diminué par l'ajout de produits chimiques, moins chers que l'enzyme elle-même, qui peuvent améliorer l'efficacité catalytique de l'enzyme. Ainsi, des expériences ont été réalisées pour le traitement de l'eau usée par la laccase avec un apport de 1- hydroxybenzotriazole (HBT, concentration de 100 µM), en tant que médiateur, ou du glycol polyéthylénique (PEG, concentration de 50 mg/L), comme additif protecteur. Les résultats expérimentaux ont montré que l'ajout de HBT a permis d'améliorer l'efficacité du traitement par la laccase pour l'oxydation des estrogènes étudiés. En effet, en 1 heure de traitement, à pH 7.0 et 25±1 ℃, l'ajout de HBT a permis de diminuer de 2-4 fois l'activité initiale en laccase nécessaire. Concernant l'ajout de PEG, bien qu'une forte concentration en PEG a été utilisée, aucune amélioration de l'efficacité du traitement enzymatique n'a pu être observée. Le plus grand intérêt dans l'enlèvement d'EDCs estrogéniques des eaux usées porte sur l'estrogénicité résiduelle après n'importe quel procédé de traitement. Plusieurs tests ont alors été menés afin de déterminer l'activité estrogénique résiduelle après une oxydation par la HRP et la laccase d'une eau usée municipale contaminée en estrogènes (E1, E2, E3 et EE2). Les résultats obtenus par le bio essai RYA ont montré qu'après une heure de traitement enzymatique de l'eau usée municipale, l'activité estrogénique a été réduite de 97% par la laccase et 92% par la HRP, et complètement enlevée, dans les deux cas, après 8 heures de traitement. Ce projet de recherche confirme donc que l'oxydation enzymatique (par HRP ou laccase) est un procédé de traitement efficace pour enlever les estrogènes (E1, E2, E3 et EE2), et leurs activités estrogéniques associées, des effluents des STEPs municipales. Ainsi, le rejet de ces composés fortement estrogéniques dans l'environnement aquatique pourrait être évité, ainsi que la perturbation endocrinienne des organismes aquatiques. Ce procédé de traitement pourrait donc servir comme traitement additionnel aux procédés conventionnels déjà en place dans les STEPs.

Abstract

The main source of natural steroid estrogens (estrone - El, 17β-estradiol- E2, and estriol- E3) in aquatic environment is related to human and animal excreta. The synthetic steroid 17a-ethinylestradiol (EE2) is a component of the contraceptive pill, and therefore exclusively originated from women. As a result, important quantities of these hormones are going through municipal wastewater treatment plants (WWTPs) effluents and directly discharged via the effluent into the aquatic environment. lndeed, several toxicity studies indicate that these compounds are largely responsible for the estrogenic effects observed in aquatic organisms exposed to those discharges. The key objective of this research was to develop a new and cost-effective treatment process for an efficient removal of natural and synthetic estrogens, as well as their associated estrogenicities, from municipal WWTPs effluents. Two processes were selected to be tested, the enzymatic oxidation of estrogens by the horseradish peroxidase (HRP) enzyme and the polyphenolic enzyme, laccase. HRP was chosen as a reference enzyme since this enzyme demonstrated being effective for phenolic compounds oxydation. Laccase was used since it could be produced at low-cost by the utilization of biosolids as growth substrate. Severallaboratory experiments were performed in batch reactors to develop and optimize the enzymatic process, and also assess the efficiency of this treatment process for the oxidation of the studied estrogens (E1, E2, E3, and EE2) present in municipal wastewater. Estrogen concentrations were determined by single-quad liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Estrogenic activity tests after enzymatic treatment were carried out by the recombinant yeast assay (RYA). The experiments performed in synthetic water showed that the optimum pH for each estrogen removal was around 6 using laccase and 7 using HRP. HRP allowed to achieve relatively high removals over a large pH range (6-8), corresponding to pH values found in municipal WWTPs. In opposite, laccase seemed to be strongly pH-dependent. HRP requires the presence of hydrogen peroxide (H₂O₂) to be activated to oxidize the phenolic compounds, such as estrogens. In synthetic water and at initial µg/L concentration of estrogens, the optimal molar peroxide-to-substrate ratio at pH 7.0 and 25±1 ℃ corresponded approximately to the theoretical molar stoichiometry ratio of 0.5. The kinetic study was performed in order to determine the affinity of both enzymes (HRP and laccase) towards each studied estrogen (E1, E2, E3, and EE2), and to assess their catalytic efficiency, showed that the oxidation by HRP and laccase exhibited a pseudo-first-order dependence on the steroid estrogen concentration and followed Michaelis-Menten kinetics in the substrate concentration ranged studied. The experiments were conducted in synthetic water at pH 7.0 and 25±1 ℃ at initial µg/L concentration of estrogens. Furthermore, based on MichaelisMenten kinetics, the experimental results showed that both enzymes present the same affinity for the studied estrogens under the experimental conditions. KM values between 1.32-7.47 µM were reported for HRP- and laccase-catalyzed systems. Moreover, values of kcat/KM ratio showed that the HRP-catalyzed process seemed to be more efficient than the laccase-catalyzed process for the removal of the studied estrogens removal from synthetic water. Several experiments were also performed with a municipal wastewater (RoIla's WWTP, Missouri, US). Based on the experimental results, within 1-hour treatment and at 25±1 ℃ a complete removal of the studied estrogens (at initial ng/L concentration) from wastewater was achieved by 10-U/mL HRP at pH 8.0 and by 20-U/mL laccase at pH 7.0. The tests showed as weIl that HRP was strongly affected by wastewater compounds, although laccase did not seem to be affected. In enzymatic treatment the associated cost to the enzyme corresponds to the most important investment part of the process. The cost can be decreased by the addition of less expensive chemicals addition, which may improve the enzyme catalytic efficiency. Thus, several experiments were carried out in wastewater with laccase and an addition of 1- hydroxybenzotriazole (HBT, 100µM), as a mediator, or polyethylene glycol (PEG, 50 mg/L) as protective additive. The experimental results showed that HBT addition allowed the improvment of the laccase-catalyzed process efficiency for the estrogens oxidation. Indeed, within 1-hour treatment at pH 7.0 and 25±1 ℃ HBT addition reduced 2-4 times the required initial laccase activity. However, with PEG addition, even if high PEG concentrations were used, no improvement could be observed. The main objective during the EDCs removal from wastewater should be the removal of their estrogenicity downstream from wastewater treatment processes. Thus, several tests were performed in order to determine the residual estrogenic activity after HRP- and laccase-catalyzed oxidation of municipal wastewater contaminated by estrogens (E1, E2, E3, and EE2). The RYA results showed that after 1-hour enzymatic treatment the estrogenic activity of the municipal wastewater was reduced by 97% with laccase-catalyzed process and 92% with HRP-catalyzed system, and completely removed, with both systems, after 8-hours treatment. This research project proves that the enzymatic oxidation (by HRP or laccase) is an effective treatment process of estrogens (E1, E2, E3, and EE2) removal, and their associated estrogenic activities, from municipal WWTPs effluents. The release of these compounds strongly estrogenic in the aquatic environment could be, thus, avoided, as well as the endocrine perturbation of aquatic organisms and so, this treatment process could be implanted as an additional treatment process to the conventional WWTPs for estrogens removal.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Co-directeurs de mémoire/thèse: Adams, Craig D.
Mots-clés libres: estrogènes; hormones stéroïdiennes; procédé de traitement; traitement enzymatique; HRP; laccase
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 04 juin 2013 19:52
Dernière modification: 06 nov. 2015 19:38
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/1352

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