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Étapes d'ultrafiltration et procédés de formulation dans la production de biopesticides à base de Bacillus thuringiensis en utilisant des eaux usées et des boues d'épuration comme substrat.

Adjalle, Kokou D. (2009). Étapes d'ultrafiltration et procédés de formulation dans la production de biopesticides à base de Bacillus thuringiensis en utilisant des eaux usées et des boues d'épuration comme substrat. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 290 p.

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Résumé

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Le but principal de ce projet de recherche est d'évaluer la nécessité d'insérer une étape d'ultrafiltration dans le procédé de production de biopesticides à base du Bacillus thuringiensis (Bt) variété kurstaki (Btk) en utilisant les milieux résiduels comme substrat de fermentation, et de développer une formulation des biopesticides ainsi obtenus. En effet, il a été prouvé, que l'usage des milieux résiduels réduit de moitié le coût de production des biopesticides Bt par rapport au milieu conventionnel de soja. Les milieux résiduels utilisés comme substrats de fermentation sont: la boue secondaire non-hydrolysée (NH), boue secondaire thermo-hydrolysée (TH) et les eaux usées des industries d'amidon (EUA). Le milieu semi-synthétique de soja est aussi utilisé comme milieu de référence. Les bouillons fermentés, qui comprennent les composants actifs (cellules, spores viables, cristaux de proteines, enzymes, proteines végétatives insecticides, etc.), sont obtenus par fermentation de Btk en bioréacteur de 15 litres. Les composants actifs sont récupérés par centrifugation des bouillons fermentés, sous forme de concentré ("culot"). Toutefois, des pertes des composants actifs ont été identifiées dans le surnageant. C'est ainsi qu'un procédé d'ultrafiltration (un des principaux objectifs de cette étude), a été optimisé pour récupérer, dans un volume réduit (rétentat), les composants actifs des surnageants des quatre milieux en vue d'augmenter l'entomotoxicité des biopesticides. Des mélanges entre les concentrés de la centrifugation (culot) et ceux d'ultrafiltration (rétentat) ont été réalisés comme de possibles formulations. Cependant, les différents mélanges obtenus, qui ont une rhéologie particulièrement complexe, ne présentaient pas toutes les propriétés requises pour une bonne l'application. D'où la nécessité de développer une formulation appropriée (autre objectif de cette étude) par la détermination et l'optimisation des concentrations des additifs de formulations anti-UV et antimicrobienne par rapport aux différents milieux (EUA, NH, TH, soja) et à travers des tests de formulation (ce sont des tests d'exposition aux radiations UV et de détermination des contaminations d'autres organismes que Bt après une durée de conservation). Un dernier objectif de cette étude est de déterminer les conditions optimales de production des poudres humides de biopesticides en séchant par pulvérisation des bouillons fermentés. La procédure consiste à optimiser les paramètres opératoires de séchage par le plan composite centré (PCC) et la méthode de réponse en surface (MRS). Dans cette étude, les cellules totales, les spores viables, le potentiel insecticide (entomotoxicité) et les activités enzymatiques sont les variables de mesure et d'analyse des résultats. Les résultats des travaux sur l'ultrafiltration ont montré qu'une membrane de 5 kDa (diamètre du pore de 0.015 µm) permet de récolter tous les composés actifs du surnageant, surtout les composés de virulence (les enzymes) qui jouent un rôle important dans le potentiel entomotoxique des biopesticides. L'efficacité d'ultrafiltration en termes de récupération d'entomotoxicité des milieux de soja, EUA, NH et TH est de 100% avec des valeurs d'entomotoxicité en spruce budwom units par litre (SBU/L) de 11.6 x 109, 14.6 X 109, 13.5 X 109 et 9.5 x 109 dans les rétentats respectifs. L'évaluation des effets des composés de virulence (protéases et chitinases) à travers la mesure d'entomotoxicité du meilleur ratio du mélange culot - rétentat, (4 g de culot + 1 mL de rétentat) a donné une augmentation de l'entomotoxicité (en SBU/L) de 4.3 x 109, 1.6 X 109, 1.4 X 109 et 4.8 x 108 respectivement pour les milieux de soja, EUA, NH et TH. Le calcul du bilan de masse des matières en suspension montre une rétention de matière sur la membrane. Cette rétention de matière qui varie avec les milieux se traduit aussi par des pertes des composés actifs par adsorption sur des particules retenues sur la membrane, d'où la nécessité d'une étude de colmatage des membranes. La rétention de la matière, qui est essentiellement une adsorption physique sur la membrane, est très élevée pour les surnageants de TH (68% des matières en suspension contre 15%, 12%, 7% respectivement pour les milieux de soja, EUA et NH). Compte tenu de ces résultats, l'étude de colmatage est essentiellement portée sur les milieux résiduels EUA et TH. Elle est faite sur une membrane de 0.2 m² avec des volumes de 2 L et 4 L de chacun des surnageants EUA et TH. Les résultats ont montré que l'augmentation du colmatage de la membrane évaluée à travers la variation du flux du perméat présente une phase stationnaire dans laquelle la résistance apparente due à la couche de colmatage est la plus élevée. Ces résistances, calculées pour 2 L de filtration, sont de 3.5x1012 et 1.8x1012 (m-1) respectivement pour EUA et TH; alors qu'avec 4 L, elles deviennent 1.2 x1012 et 2.1x1013 (m-1) pour EUA et TH respectivement. Pour la formulation anti-UV, les résultats obtenus avec les tests d'exposition aux radiations UV montrent qu'en absence des additifs de protection, les boues d'épuration possèdent une meilleure protection contre les radiations UV-A (400-315 nm) et UV-B (315-280 nm). Les demi-vies d'entomotoxicité sont NH (3.4 j)>TH (3.25 j)>EUA (1.9 j)>soya (1.8 j). Avec les différents additifs de protection, les résultats ont montré que la formulation avec l'acide p-amino benzoïque à 0.20% (p/p) a augmenté la demi-vie d'entomotoxicité de EUA (7.8 j) et de soya (5.9 j) alors que l'acide lignosulfonique à 0.20% (p/p) donne un meilleur résultat dans le cas de TH (7.3 j) et NH(8 j). Concernant les formulations antimicrobiennes, après trois années de conservation, Parmi les microorganismes visés (salmonelles, streptocoques fécales, coliformes• fécales, les staphylocoques, les levures et moisissures), seules les moisissures ont été décelées dans certaines formulations à faible concentration des additifs (0.1 % p/p) et dans les contrôles. L'efficacité des additifs évalué à travers les valeurs d'entomotoxicité et des spores viables ont montré que l'acide propionique donne de meilleurs résultats dans les cas de soya, EUA et NH avec des concentrations respectives de 0.5%, 0.5% et 0.3% (p/p): Pour le milieu de TH, c'est le métabisulfite de sodium qui paraît le plus efficace à 0.3% (p/p). L'optimisation de la production des poudres humides de biopesticides a donné des valeurs de températures de sortie relativement faibles et qui sont loin d'affecter les spores et les cristaux de protéines insecticides. Aussi, les coefficients de détermination sont très faibles avec les valeurs d'entomotoxicité. Alors, seules les valeurs de spores viables ont servi aux analyses statistiques de la MRS (coefficient de détermination: EUA - 92% et TH - 94%) pour déterminer les conditions optimales de production de poudre humide. Le débit d'alimentation de 0.29 g/min, le débit d'aspiration d'air chaud de 0.51 m³/min, la température d'entrée de 180 °c et la pression d'atomisation de 0.10 MPa sont les valeurs optimales dans le cas de EUA. Les valeurs optimales dans le cas de TH sont 0.45 g/min, 0.49 m³/min, 170°C et 0.096 MPa. Avec ces conditions optimales on obtient des pertes de spores viables de 18% et 13% respectivement pour les poudres humides d'EUA et TH par rapport à leurs bouillons fermentés initiaux respectifs.

Abstract

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The principal objective of this research project is to evaluate the necessity of ultrafiltration step in the production process of Bacillus thuringiensis (Bt) var. kurstaki (Btk) by using wastes as substrate. It has been established that the use of the residual media and especially the wastewater and wastewater sludge, decreases the production cost of Bt biopesticides by almost half when compared to conventional media. The culture media used for the study were: non-hydrolyzed sludge (NH), hydrolyzed sludge (TH) and starch industry wastewater (SIW). Soya semi- synthetic medium was included as a control. Fermented broths comprising the active components (viable cells, spores, protein crystals, enzymes, etc.) are obtained by fermentation of Btk in a fermentor of 15 Hters. The active components are recovered by centrifugation of the fermented broths, in the form of concentrate ("base"). Mostly, losses of the active components were detected in the supernatant of centrifugation. Thus, a process of ultrafiltration (one of the principal objectives of this study), was optimized to recover, in a decreased volume (retentate), the active components in the supernatants of the four media in order to increase the entomotoxicity of the biopesticides. A mixture of concentrate of centrifugation (base) and that of ultrafiltration (retentate) was evaluated as possible formulate concentrates. Additionally, the various mixtures obtained have a complex rheology, and do not encompass the necessary properties to be used during application. It is thus necessary and essential to develop a suitable formulation in order to circumvent the drawbacks of the fermented broths. The biopesticides thus formulated will possess the properties and characteristics required for their marketing and application. This objective comprises determination and optimization of anti-UV and antimicrobial additives in various media of SIW, NH, TH and soya. The study included variation (screening) and optimization of the concentrations of these additives through various tests of formulation. Tests of exposure to UV radiations and contamination after storage time were performed. Final objective of this study is to determine the optimum conditions for the production of wet powder formulation of biopesticides of SIW and TH by drying the fermented broth in a spray dryer. The procedure consisted of optimizing the operational parameters by central composite plan (CCP) and the response surface method (RSM). The spray drying operational parameters (inlet temperature, flow of aspiration of hot air, atomization pressure and feed rate) constitute independent variables, whereas the outlet temperature, moisture content, number of viable spores and entomotoxicity are dependent variables. It should be noted that to accomplish all the objectives of this study, total cells, viable spores, insecticidal potential (entomotoxicity) and enzymatic activity are the variables of measurement and analysis of the results. For the first objective (ultrafiltration), the results showed that a membrane of 5 kDa (pore diameter of 0.015 µm) with a surface area of 0.1 m² was optimal for concentration of all composants present in supernatant, especially the virulence factors (enzymes, vegetative insecticidal proteins, zwittermicin-A) which play a significant role in the entomotoxicity of the biopesticides. Efficiency of ultrafiltration in terms of entomotoxicity recovery for soya, SIW, NH and TH were 100% with entomotoxicity values of 11.6, 14.6, 13.5 and 9.5 (x 109 SBU/L) in the respective retentates. The evaluation of the effects of virulence factors (proteases and chitinases) for a ratio of the centrifugate-retentate, (4g of centrifugate + 1 mL of retentate) gave an increase in the entomotoxicity of 4.3, 1.6, 1.4 and 4.8 (10 9 SBU/L) for soya, SIW, NH and TH, respectively. Meanwhile, there were losses of active components on the ultrafiltration membrane through the adsorption of matter on the membrane, necessitating further experiments on membrane fouling. The retention of organic matter, via physical adsorption on the membrane, is very high for the supernatants of hydrolyzed sludges (68% of the suspended matter as compared to 15%, 12%, 7% for soya, SIW and NH, respectively). Taking into account the preceding results and objectives of this work, the membrane fouling study was performed for 0.2 m² membrane with a volume V (2 Land 4 L) of supematants of SIW and TH. The results showed that increase in fouling of the membrane evaluated through the variation of the flow of permeate presented a stationary phase in which apparent resistance of the fouled layer was maximum. This resistance, calculated for 2 L of filtration, was 3.5x1012 and 1.8x1012 (m-1) for SIW and TH, respectively. These values were 1.2 xl012 for SIW and 2.1xl013 (m-1) for TH in the case of 4 L of filtration. For the anti-UV formulation, the results obtained during UV exposure tests showed that in the absence of protection additives, the wastewater sludge gave better protection against UV-A and UV-B radiations. The half-lives calculated in terms of entomotoxicity were NH (3.4 d)>TH (3.25 d)>SIW (1.9 d)>soya (1.8 d). The study of various additives of UV protection showed that the formulation with p-amino benzoic acid at 0.20% w/w increased the half-life in terms of entomotoxicity for SIW (7.8 d) and soya (5.9 d) whereas lignosulfonic acid at 0.20% w/w gave better results for TH (7.3 d) and NH (8 d). For tests using antimicrobial formulations, after three years of conservation, Among the microorganisms concerned (Salmonella, Streptocoques fecal, coliforms, Staphylococci, yeasts and moulds), only the moulds were detected in certain formulations with weak concentration of the additives (0.1 w/w) and in controls. The effectiveness of the additives evaluated through the values of entomotoxicity and viable spores showed that the propionic acid gives better results in the cases of soya, SIW and NH with respective concentrations of 0.5%, 0.5% and 0.3% (w/w). For the medium of TH, it is the sodium metabisulfite which appears most effective to 0.3% (w/w). The optimization of production of wet powder formulations showed that the values of outlet temperatures were relatively low for the two media (SIW ant TH), and are far from affecting the spores and the insecticidal crystal proteins. Also, the model determination coefficients are certainly very low for entomotoxicity. Thus, only the viable spore values were used for statistical analyses by response surface method. With the spores, the model determination corficient of optimal conditions for the production of wet powders gave 92% and 94%, for SIW and TH, respectively. The feed rate of 0.29 g/min, aspiration of hot air of 0.51 m³/min, the inlet temperature of 180 °C and the pressure of atomization of 0.10 MPa were the optimal values of independent variables in the case of SIW. The optimal values in the case of TH are 0.45 g/min, 0.49 m³/ min, 170 °C and 0.096 MPa. With these optimal conditions, viable spore losses of 18% and 13% respectively, were obtained for the wet powders of SIW and TH compared to their respective initial fermented broths.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Co-directeurs de mémoire/thèse: Valéro, José R.
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: biopesticide; Bacillus thuringiensis; eaux usée; boues d'épuration; fermentation; BT
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 30 mai 2013 18:11
Dernière modification: 06 nov. 2015 16:19
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/1335

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