Développement d'un kit d'immunio-détection rapide et spécifique de l. monocytogènes sur une membrane à base de biopolymère pour les surfaces en industrie alimentaire.

Etty, Marie-Christine (2017). Développement d'un kit d'immunio-détection rapide et spécifique de l. monocytogènes sur une membrane à base de biopolymère pour les surfaces en industrie alimentaire. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 196 p.

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Résumé

Face au défi que représente le temps d’analyse des méthodes de détection officielles existantes, le développement d’une méthode de détection basée sur le couplage de l’étape d’enrichissement sélectif de Listeria monocytogenes et de sa détection spécifique représente une solution potentielle à l’amélioration de sa surveillance en santé publique. Dans cette optique, des travaux de recherche ont été effectués sur la protéine p60 impliquées dans la virulence et la croissance de L. monocytogenes. Cette protéine p60 a été choisie puisqu’elle contient une séquence de 11 acides aminées (peptide D ou PepD : QQQTAPKAPTE) unique à l’espèce Listeria monocytogenes. Ainsi, les résultats obtenus permettent de montrer que le milieu Listeria enrichment broth (LEB) est le meilleur milieu d’enrichissement sélectif favorisant une meilleure croissance de L. monocytogenes et une meilleure expression de la protéine p60 (Beauchamp et al., 2012b; Coutu et al., 2014). Néanmoins, l’expression de la protéine p60 dans le LEB est retardée par la présence d’agent sélectif. D’où, la modification du LEB à une concentration optimale de 0,5% de dextrose (LEB modifié) a été effectuée afin de favoriser l’expression précoce de la protéine p60. Par la suite, une membrane (CCG)à base de chitosane (Cs), de nanocristaux de cellulose (CNC) et de glycérol (Gly) a été développée dans le but d’immobiliser des anticorps monoclonaux anti-peptide D de la protéine p60 de L. monocytogenes (mAb anti-PepD). La caractérisation des composantes de la membrane CCG a permis de mettre en évidence la présence de groupements amines (NH2) provenant du chitosane. Par ces groupements amines, une liaison covalente entre la membrane CCG et les groupements amines présents dans mAb anti-PepD a été mis en place via le glutaraldéhyde. L’optimisation de cette méthode a mis en évidence l’importance du renforcement de la résistance de la membrane CCG par la CNC sur l’efficacité d’immobilisation. La validation du support optimisé pour l’immobilisation de mAb anti-PepD dans le LEB modifié a montré que la détection spécifique de la protéine p60 de L. monocytogenes n’est pas affectée sur la membrane CCG et est plus efficace que la méthode faisant intervenir l’utilisation d’une microplaque standard. Enfin, le transfert de la membrane CCG en une version applicable dans une trousse de détection des échantillons environnementaux a permis de réduire le temps d’analyse à moins de 48 heures pour une contamination de 102 UFC/900cm2 de L. monocytogenes. Néanmoins, une réduction des interactions non-spécifiques est nécessaire sur cette version potentielle de la membrane CCG de la trousse de détection afin que la spécificité de mAb anti-PepD ne soit pas affectée.

In order to overcome the problems associated with the time of analysis using the standard methods of detection, the development of a detection method based on the coupling of the selective enrichment step of L. monocytogenes and its specific sensing represents a potential solution to improve its surveillance in public health. To this end, this research has been performed on the p60 protein involved in the virulence and growth of L. monocytogenes. This p60 protein was also chosen because it contains a short sequence of eleven amino acids (peptide D or pepD: QQQTAPKAPTE) unique to L. monocytogenes. The results obtained showed that Listeria Enrichment Borth (LEB) is the best selective enrichment medium to improve the growth of L. monocytogenes and the expression of its p60 protein (Beauchamp et al 2012b; Coutu et al, 2014). This p60 protein is suitable for the detection of L. monocytogenes due to its involvement in growth and virulence. However, the expression of the p60 protein in LEB is delayed by the presence of selective agents. Hence, the modification of LEB at an optimal concentration of 0.5% dextrose (modified LEB) was performed to promote an early expression of the p60 protein. Subsequently, a membrane (CCG) based on chitosan (Cs), cellulose nanocrystal (CNC) and glycerol (Gly) was developed in order to immobilize a monoclonal antibody that recognizes peptide D of the L. monocytogenes p60 protein (anti-PepD mAb). The chemical characterization of the CCG membrane confirmed the presence of free amino groups provided by chitosan. With these free amino groups on the surface of the CCG membrane, a covalent link between the free amino groups on the surface of the CCG membrane and the free amino groups of the anti-PepD mAb was established using glutaraldehyde. The optimization of this immobilization method was performed and showed that the reinforcement of the CCG membrane by CNC is important for the immobilization efficiency. The use of the optimized support in the modified LEB for the detection of L. monocytogenes p60 protein was not affected on the CCG membrane and was more effective than the standard microplate detection method. Finally, the transfer of the CCG membrane to an applicable version of a detection kit for an environmental sample resulted in a reduction of the detection time to less than 48 hours for a contamination of 102CFU/900cm2 of L. monocytogenes. However, a reduction in non-specific reactions is required on this potential version of the CCG membrane to improve the specificity of detection with anti-PepD mAb.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Lacroix, Monique
Co-directeurs de mémoire/thèse:	D'Auria, Sabato (ltalian National Research Council lnstitute of Protein.)
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	29 avr. 2018 05:32
Dernière modification:	02 mars 2022 16:23
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/6688

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