Régulation de l'expression des connexines dans la différenciation de l'épithélium épididymaire

Adam, Cécile (2017). Régulation de l'expression des connexines dans la différenciation de l'épithélium épididymaire Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 223 p.

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Résumé

L’épididyme est l’organe responsable de la maturation des spermatozoïdes, son rôle est essentiel dans l’acquisition de la fertilité masculine. Ce processus crucial est dépendant des interactions entre les spermatozoïdes et le microenvironnement luminal de l’épididyme. La composition de ce microenvironnement spécifique est régulée par les différents types cellulaires présents au sein de l’épithélium de l’épididyme et évolue tout au long de cet organe. Afin de synchroniser leurs actions, les cellules épithéliales communiquent entre elles par l’intermédiaire des jonctions lacunaires. Les jonctions lacunaires sont composées de canaux transmembranaires entre deux cellules adjacentes, ce qui leur permet de communiquer par la diffusion directe d’ions et de petites molécules. Les connexines (Cxs) sont les protéines qui composent ces canaux transmembranaires. Dans l’épididyme du rat, Gjb5 (Cx30.3), Gjb4 (Cx31.1), Gjb1 (Cx32) et Gja1 (Cx43) sont présentes au sein de l’épithélium adulte différencié alors que Gjb2 (Cx26) est uniquement détectable chez les jeunes animaux, lorsque l’épithélium est indifférencié. Ces changements d’expression des Cxs modifient la sélectivité des jonctions lacunaires et permettent aux cellules de l’épithélium de modifier leurs échanges. On observe un changement de l’expression des Cxs pendant la différenciation du tissu, ce qui suggère un rôle clé des Cxs dans la régulation de la différentiation de l’épithélium épididymaire. Il n’existe aucune information sur la régulation transcriptionnelle des Cxs dans l’épididyme durant la différenciation.L’objectif principal de ce projet était d’identifier les mécanismes impliqués dans la régulation de l’expression des Cxs lors de la différentiation de l’épididyme. Afin d’élucider de tels mécanismes, le promoteur de Gjb2 a été caractérisé. Les résultats ont montré que Gjb2 possède un site unique d’initiation de la transcription au sein de l’épididyme. L’analyse de la séquence du promoteur de Gjb2 a révélé la présence de sites de liaison possibles des facteurs de transcription SP1 (Specificity Protein 1) et TFAP2A (Transcription Factor Activating Protein 2 Alpha). Nous avons montré que la région basale du promoteur se situe dans les 230 pb en amont du site d’initiation de la transcription identifié. Des expériences de mutation dirigées et de retard sur gel ont confirmé la liaison de SP1 et TFAP2A au promoteur de Gjb2 ainsi que leurs implications dans l’activation de cette Cx. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont permis de montrer que la liaison de ces facteurs de transcription diminue avec l’âge, ce qui corrèle avec la diminution de l’expression de Gjb2. Ces résultats confirment le rôle activateur de SP1 et TFAP2A dans l’expression de Gjb2 chez les jeunes individus. Nous nous sommes ensuite intéressés aux mécanismes impliqués dans la diminution de Gjb2 lors de la différenciation. La méthylation du promoteur de Gjb2 et le facteur KLF4 (Krüppel-like factor 4) ne sont pas impliqués dans la diminution de la liaison de SP1 et TFAP2. Le rôle des hormones dans la régulation des Cxs a également été évalué. À l’aide de tissus de rats castrés et de rats castrés avec implant de testostérone, nous avons montré que Gjb2 et Gjb1 sont régulés par les androgènes. La castration augmente les niveaux de protéines de GJB2 et diminue ceux de la GJB1 au sein de l’épididyme. De plus, les androgènes régulent également les niveaux protéiques de GJB4 dans l’épididyme. Nous avons également évalué le rôle des glucocorticoïdes (hydrocortisone et dexaméthasone) et de l’oestradiol sur l’expression de Gjb2. Nous avons montré que les glucocorticoïdes augmentent les niveaux d’ARNm de Gjb2 alors que l’oestradiol n’a pas d’effet. Le promoteur de Gjb1 a également été étudié dans les cellules épididymaires et dans le tissu. Nos résultats montrent que Gjb1 est transcrit par le promoteur P1 dans l’épididyme alors qu’il est transcrit par le promoteur P2 dans les cellules RCE-1. Nous avons cloné 5kb du promoteur de Gjb1 dans un plasmide rapporteur de luciférase afin d’étudier son activité transcriptionnelle. Nous avons identifié des éléments de réponse aux glucocorticoïdes, aux oestrogènes et aux androgènes sur le promoteur de Gjb1. Nos résultats suggèrent que les androgènes jouent un rôle dans l’expression de Gjb1. Dans l’ensemble, ces travaux permettent une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de l’expression des Cxs dans l’épididyme. De plus, les données générées dans cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes responsables des changements d’expression des Cxs dans d’autres tissus ainsi que dans certaines pathologies impliquant ces deux Cxs.

The epididymis is the organ responsible for sperm maturation and plays an essential role in the acquisition of male fertility. This critical process is dependent on interaction of spermatozoa with the luminal microenvironment of the epididymis. The composition of this specific microenvironment is regulated by the epithelial cells of the epididymis and changes throughout the organ. This suggests a complex coordination of epithelial cells. Cellular communication is crucial for cell coordination and is orchestrated by gap junctions. These junctions form transmembrane channels between adjacent cells, which enable them to communicate by direct exchange of ions and small molecules. Connexins (Cxs) are proteins that form these transmembrane channels. In the adult rat epididymis, Gjb5 (Cx30.3), Gjb4 (Cx31.1), Gjb1 (Cx32) and Gja1 (Cx43) are present while Gjb2 is only detectable in young animals when the epithelium is undifferentiated. Change in the expression of Cxs is associated with changes in gap junctional permeability that allow cells to modify their exchanges. During epididymal epithelial differentiation, there is a change in the expression of Cxs, suggesting a key role of Cxs the regulation of the differentiation of the epididymal epithelium. There is no information on the transcriptional regulation of the Cxs in the epididymis. The main objective of this project was to identify the mechanisms involved in the regulation of the expression of Cxs during epididymal differentiation. To elucidate these mechanisms, the promoter of Gjb2 was first characterized. The results showed a single transcriptional start site for Gjb2 in the epididymis. The analysis of the sequence of the Gjb2 promoter revealed the presence of potential binding sites for transcription factors SP1 (Specificity Protein 1) and TFAP2A (Transcription Factor Activating Protein 2 Alpha). We have shown that the basal promoter region is located within the 230 bp upstream of the identified initiation start site. Directed mutagenesis and EMSA experiments confirmed the binding of TFAP2A and SP1 on the Gjb2 promoter and their role in the activation of this Cx. ChIP experiments showed that the binding of these transcription factors decreases with age, which correlates with the decreased expression of Gjb2. These results confirm the activating role TFAP2A and SP1 in the transcriptional activation of Gjb2 in young animals. We then looked at the mechanisms involved in the decrease of Gjb2 during differentiation. It appears that the methylation of the promoter of Gjb2 and KLF4 factor (Kruppel-like factor 4) are not involved in the decreased binding of SP1 and TFAP2 with age. Finally, the role of hormones in the regulation of Gjb2 and Gjb1 was investigated in the epididymis. Using tissue from orchidectomized rats and orchidectomized rats with testosterone implants, we showed that Gjb2 and Gjb1 are regulated by androgens in the epididymis and ventral prostate. Orchidectomy increases the protein levels of Gjb2 and decreases those of Gjb1. Moreover, Gjb4 levels were decreased with orchidectomy. We also evaluated the role of glucocorticoids (hydrocortisone and dexamethasone) on the expression of Gjb2 and we have shown that glucocorticoids increase the mRNA levels of Gjb2. Estradiol did not have an effect on Gjb2 expression. The promoter of Gjb1 was also characterized in epididymal cells as in the tissue. Our results show that Gjb1 is not transcribed from the same promoter in the cells and in the tissue. In the tissue, Gjb1 is transcribed from P1 whereas in the cells it is transcribed from P2. DNA sequence analysis showed androgen, estrogen and glucocorticoid response elements on the promoter of Gjb1. Our results suggest that androgens are involved in the regulation of Gjb1 gene expression. Overall, this work provides a better understanding of the mechanisms regulating the expression of Cxs in the epididymis during the differentiation of the epithelium. Furthermore, the data generated in this study will help to better understand the mechanisms regulating the expression of Cxs in other tissues as well as in certain diseases that involve both Cxs.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Cyr, Daniel G.
Mots-clés libres:	appareil reproducteur mâle ; épididyme ; différenciation ; Gjb2 ; Gjb1 ; promoteur ; régulation transcriptionelle SP1 ; TFAP2A ; androgènes ; male reproductive tract; epididymis; differentiation; Gjb2; Gjb1; promoter; transcriptional regulation; androgens; SP1; TFAP2A.
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	14 juin 2017 14:30
Dernière modification:	04 mai 2023 14:08
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/5268

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