Les effets du cadmium sur le système immunitaire de la moule bleue, Mytilus edulis : un modèle in vitro et une approche transcriptomique

Granger Joly de Boissel, Philippine (2018). Les effets du cadmium sur le système immunitaire de la moule bleue, Mytilus edulis : un modèle in vitro et une approche transcriptomique Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 195 p.

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Résumé

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Le cadmium (Cd) est un métal divalent non essentiel connu comme étant toxique pour les organismes. On le retrouve dans tous les écosystèmes et sur le globe terrestre à des concentrations plus ou moins importantes en raison de l'érosion des sols, des incendies de forêt, mais plus encore dû au secteur de l'industrie et aux activités minières. Les principaux réceptacles de la contamination au Cd sont les écosystèmes aquatiques. Dans ces écosystèmes, les bivalves sont exposés à la contamination de leur environnement. Ces organismes sont sédentaires, filtreurs d'eau et accumulateurs de métaux ; ils ne peuvent donc pas échapper aux pressions dû aux activités humaines (ou pressions anthropiques). Pour ces raisons, les bivalves, plus particulièrement les moules, sont considérés comme des bioindicateurs et donc utilisés comme organismes modèles pour caractériser la contamination de leurs écosystèmes. Ils sont constamment exposés aux changements abiotiques (pH, C02, température, etc.) et biotiques (bactéries, virus, toxines, etc.). Afin de se protéger, leur première barrière de défense est leur système immunitaire inné (ils n'ont pas de système immunitaire adaptatif), l'hémolymphe, composée de cellules hémocytaires (hemocytes) et de composant humoraux. La principale fonction des hémocytes est de phagocyter des corps étrangers comme des agents pathogènes ou des particules. Les composants humoraux sont responsables de reconnaître et de détruire les corps étrangers. Parce que les moules sont sous pression anthropique et leur principale défense est leur système immunitaire inné, nous avons émis l'h1ypothèse que le cadmium pouvait affecter l'expression de gènes liés à l'immunité plus spécifiquement aux processus de phagocytose. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons mise en place un modèle mécanistique, Nous avons développé un modèle in vitro dans lequel nous avons exposé les hémocytes de moules à une gamme de concentration de cadmium (de 10-9M à 10-3M) pour mesurer l'activité phagocytaire et la viabilité cellulaire. Nous avons ensuite séquencé le transcriptome (RNA-seq) des hémocytes non exposés et des hémocytes exposés à 10-3M Cd pour réaliser une analyse des mécanismes induits et une analyse différentielle de l'expression des gènes (DGE). Ensuite nous avons sélectionné des gènes qui pourraient caractériser la toxicité au cadmium et finalement nous avons validé l'expression génique de potentiels marqueurs en utilisant une approche RT-qPCR. Nous avons également corrélé l'expression des gènes avec les paramètres fonctionnels (phagocytose et viabilité cellulaire).

Les résultats obtenus ont montré que les moules exposées à 10-3M de Cd ont présenté plus de mortalité cellulaire et une forte diminution de leur activité phagocytaire (directement liée à la présence de cadmium et non pas causée par la mortalité cellulaire mesurée). L'analyse RNA-seq a permis de reconstruire un transcriptome de nova contenant 189422 contigs (séquence génomique provenant des analyses post-séquençage) et l'annotation a permis de caractériser 23,2% du transcriptome. Le DGE a montré que 1028 transcrits étaient surexprimés en présence de Cd et 84 étaient sous-exprimés. À partir de 1112 transcrits, vingt-deux gènes ont été sélectionnés comme des biomarqueurs potentiels. Nous avons ciblé un transcrit impliqué dans les voies de calcium (Calmoduline), quatre senseurs pathogènes (TLR et RIG-1), trois gènes impliqués dans la mobilité cellulaire (Actin, TPS5 et NAS13) et trois dans l'apoptose et les dommages à l'ADN. Pour valider notre modèle nous avons également étudié cinq gènes impliqués dans la cytotoxicité du Cd (SOD, MRP1, CYP2C8, GST et HSP70). De tous les gènes présélectionnés, nous avons validé l'expression de douze gènes via une retro-transcription suivit d'une amplification en chaîne par polymérase semi-quantitative en temps réelle (RT-qPCR). Les résultats ont montré que les deux technologies utilisées pour l'expression génique sont comparables (DGE vs RT-qPCR). Cette étude est la première qui identifie les effets du cadmium sur des transcripts impliqués dans l'immunité des bivalves. L'induction des TLRs, RIG-1, NAS13 et XIAP n'avait pas été étudié après une exposition au cadmium, cependant ils ont un rôle essentiel dans la phagocytose et la défense cellulaire. Par ailleurs, l'analyse du transcriptome, en générale, a révélé que le cadmium induit aussi des gènes impliqués dans les processus apoptotiques.

Finalement, dans notre étude nous proposons douze nouveaux marqueurs qui caractérisent la toxicité du Cd dans les hémocytes de moules.

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Cadmium (Cd) is a non-essential divalent metal known to be taxie for organisms. lt can be found in all of the world at different concentrations due to the soil erosion, forest tire, but more over because of industry and mining activities. The main receptacles of Cd contamination are aquatic ecosystems. ln these ecosystems, bivalves, filter-feeders' organisms are exposed to the contamination of their surroundings. They are sedentary, accumulator of metals and they cannot escape to the anthropic pressures. For these reasons, bivalves, more specifically mussels, are considered as bioindicators and they are used as model organisms to characterize the contamination of their ecosystems. Also, they are exposed to abiotic (pH, C02, temperature, etc.) and biotics (bacteria, virus, toxins, etc) changes. Their first defense is the hemolymph, open vascular innate immune system, which is composed by hemocytes and humoral components (they lack of adaptive immune defense ). The main function of hemocytes is to phagocyte foreign bodies as pathogens or particles. The humoral components are responsible to recognize and destroy foreign bodies. Because mussels are under anthropic pressures and their main defense is their innate immune-system, we have hypothesized that cadmium may affect the expression of immune-related genes involved into phagocytosis processes of mussels's hemocytes. To develop our hypothesis, we have 1) developed an in vitro model exposing mussels' hemocytes to different concentration of cadmium (from 10-9M to 10-3M) to measure phagocytosis activity; 2) sequenced the transcriptome (RNA-seq analysis) of non-exposed hemocytes and 10-3M-exposed hemocytes to compare gene expression (DGE analysis) and select potential genes that could characterize cadmium toxicity and 3) validate the gene expression of selected genes using a RT-qPCR approach. We have also correlated gene expression with functional parameters (phagocytosis and cell viability). The results obtained have shown that mussels exposed to 10-3M of Cd presented more cell mortality and a strong decrease in their phagocytic activity. The RNA-seq analysis has permitted to rebuild a de nova transcriptome containing 189422 contigs and the annotation has allowed to characterize 23.2% of the transcriptome.

The DGE as shown that 1028 transcripts were over expressed in presence of Cd and 84 underexpressed. From 1112, twenty-two genes were selected has potential biomarkers including one in calcium pathways (Calmodulin), four pathogens sensors (TLRs and RIG-1 ), three genes involved in cell mobility (Actin, TPS5 and NAS13) and three in apoptosis and DNA damages, we also studied five genes involved in Cd cytotoxicity (SOD, MRP1, CYP2C8, GST and HSP70) to validate our model.

Of all the pre-selected genes, we validated the expression of twelve genes via RT-qPCR. The results showed that the two technologies used for gene expression are comparable (DGE vs RTqPCR). This study is the first to identify the effects of cadmium on transcripts involved in bivalve immunity. Induction of TLRs, RIG-1, NAS13 and XIAP had not been studied after exposure to cadmium, however they have an essential raie in phagocytosis and cell defense. ln addition, transcriptome analysis, in general, revealed that cadmium also induces genes involved in apoptotic processes.

Finally, in our study we propose twelve new markers that characterize the toxicity of Cd in the hemocytes of mussels.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Fournier, Michelet Girard, Denis
Co-directeurs de mémoire/thèse:	Siah, Ahmed (BC Centre for Aquatic Health Sciences)
Mots-clés libres:	cadmium ; moule bleue ; système immunitaire ; hemocytes ; transcriptomique ; expression génique ; RNA-seq ; biomarqueurs ; in vitro ; blue mussel; transcriptome; gene expression; biomarkers
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	06 nov. 2024 15:03
Dernière modification:	06 nov. 2024 15:03
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/15918

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