Genetic events responsible for cell shape evolution in multicellular longitudinally dividing (MuLDi) oral cavity Neisseriaceae

Sichangi, Sammy (2023). Genetic events responsible for cell shape evolution in multicellular longitudinally dividing (MuLDi) oral cavity Neisseriaceae Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 149 p.

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Résumé

The bacterial cell shape is an important trait that enhances their survival and colonisation of various ecosystems. Numerous studies over the years have implicated the peptidoglycan together with the cell division and elongation machineries as the main determinants of the bacterial morphology. Indeed, majority of bacterial morphogenesis mechanisms have been described principally in pathogens, particularly using bacilli, cocci and spiral shaped bacterial models. Even more intriguing is the fact that some of these mechanisms are well conserved across species with varying morphologies, while in other species variations in gene conservation and function may exist even in morphologically similar species. These attributes highlight the importance of studying additional bacterial species and varying morphologies to better understand the fundamental biological processes that shape the bacterial cell.

In this thesis, I used the cell shape of 5 multicellular Neisseriaceae characterised with incomplete and longitudinal cell division (MuLDi), as models to study cell shape evolution from a bacilli shaped ancestor. The study aimed to use the atypical morphology and cell division of MuLDi bacteria to determine the role of proteins implicated in the morphological transition in addition to describing the cellular and peptidoglycan structure organization during the growth and cell division of these species.

Cells and peptidoglycan extracts were imaged through scanning and transmission electron microscopy techniques to reveal a common outer membrane and lateral peptidoglycan fusion in MuLDi Neisseriaceae. Labelling of nascent peptidoglycan using fluorescent D-amino acids revealed longitudinal septation that begins from one end in Alysiella species while in Simonsiella muelleri and Conchiformibius species, septation begins from both ends moving inwards. To determine the genetic factors implicated in the morphological transition, we obtained complete genomes of 5 MuLDi species namely; S. muelleri, A. filiformis, A. crassa, C. steedae and C. kuhniae plus 16 bacilli Neisseriaceae genomes through PacBIO and Nanopore sequencing technologies. A further 20 bacilli Neisseriaceae genomes were obtained from the NCBI database. Comparative genomic analyses revealed that the loss of mraZ, rapZ, dgt, gloB, acquisition of peptidoglycan amidase amiC2 and amino acid substitutions in divisome and elongasome proteins MreB and FtsA as possible events associated with the evolution of MuLDi morphology. Transcriptomic analysis between bacilli and MuLDi species revealed that the division and cell wall cluster (dcw) genes ftsI and murE were downregulated in MuLDi species. The deletion of mraZ in wildtype N. elongata had no morphological changes, significant cell length reduction was however realized upon overexpressing mraZ. Transcriptomic analyses revealed the upregulation of the dcw cluster genes mraW, ftsL, ftsI, murE and murF in the mraZ overexpressing strain compared to the knock out. The accumulation of 4 gene deletions (mraZ, rapZ, dgt, gloB) had no effect on N. elongata shape, but insertion of cdsA-amiC2 and allelic substitution of N. elongata mreB with that of S. mueller resulted in cells with significantly longer septum and shorter width in both wild-type and four gene mutant N. elongata.

Overall, this Ph.D. work highlights Neisseriaceae family as an important model to study bacterial morphogenesis, and identifies the loss of mraZ, insertion of amiC2 and amino acid substitutions on MreB as important events associated with the MuLDi to bacilli transition.

La forme des cellules bactériennes est un trait important qui favorise la survie et la colonisation de divers écosystèmes. Etudes au cours des années ont impliqué le peptidoglycane ainsi que les mécanismes de division et d'élongation cellulaire comme les principaux déterminants de la forme de la cellule bactérienne. En effet, la majorité des mécanismes de morphogenèse bactérienne ont été décrits principalement chez les agents pathogènes, notamment à l'aide de bacilles, de cocci et de modèles bactériens en forme de spirale. Ce qui est encore plus intriguant, c'est que certains de ces mécanismes sont bien conservés entre des espèces de morphologies différentes, alors que chez d'autres espèces, des variations dans la conservation et la fonction des gènes peuvent exister même chez des espèces morphologiquement similaires. Ces caractéristiques soulignent l'importance d'étudier d'autres espèces bactériennes de morphologies différentes afin de mieux comprendre les processus biologiques fondamentaux qui façonnent la cellule bactérienne.

Durant cette thèse, nous avons utilisé la forme cellulaire de cinq Neisseriaceae multicellulaires qui résident dans la cavité oropharyngée des mammifères et qui sont caractérisées par une division cellulaire incomplète et longitudinale (MuLDi), comme modèles pour étudier l'évolution de la forme cellulaire à partir d'un ancêtre en forme de bacille. L'étude visait à déterminer le rôle des protéines impliquées dans la transition morphologique ainsi qu'à décrire l'organisation de la structure cellulaire et du peptidoglycane pendant la croissance et la division cellulaire de ces espèces.

Des cellules et des extraits de peptidoglycane ont été imagés par des techniques de microscopie électronique à balayage et à transmission pour révéler la fusion septale. Le marquage du peptidoglycane naissant à l'aide d'acides aminés D fluorescents a révélé une septation longitudinale, avec une division cellulaire unipolaire chez Alysiella spp. tandis que S. muelleri et Conchiformibius spp. ont des modes bipolaires de division cellulaire. Pour déterminer les facteurs génétiques impliqués dans la transition morphologique, nous avons obtenu les génomes complets de 5 espèces de MuLDi, à savoir : S. muelleri, A. filiformis, A. crassa, C. steedae et C. kuhniae, et 16 génomes de bacilles Neisseriaceae grâce aux technologies de séquençage PacBIO et Nanopore. 20 génomes de Neisseriaceae bacilles supplémentaires ont été obtenus à partir de la base de données NCBI. Les analyses génomiques comparatives ont impliqué une combinaison de délétions génétiques (mraZ, rapZ, dgt, gloB), d'insertions (amiC2) et de substitutions d'acides aminés dans MreB et FtsA comme facteurs possibles associés à la morphologie de MuLDi.

La comparaison des données transcriptomiques entre les bacilles et les espèces MuLDi a révélé que les gènes de division et de parois cellulaires (dcw) ftsI et murE étaient moins exprimés chez ces derniers. La délétion du gène mraZ chez N. elongata sauvage n'a entraîné aucun changement morphologique, alors qu’une réduction significative de la longueur des cellules a cependant été réalisée lors de sa surexpression. Les analyses transcriptomiques ont révélé une augmentation dans l’expression des gènes du cluster dcw (mraW, ftsL, ftsI, murE et murF) dans la souche surexprimant mraZ par rapport à la souche knock-out. La délétion de quatre gènes (mraZ, rapZ, dgt et gloB) n'a pas eu d'effet sur la forme de N. elongata. Cependant, l'insertion de cdsA-amiC2 et la substitution allélique de mreB de N. elongata par celui de S. muelleri ont mené à la formation de cellules bactériennes avec un septum significativement plus long et une largeur plus courte lorsque ces modifications génétiques étaient effectuées chez N. elongata sauvage et chez mutant à quatre gènes.

Dans l'ensemble, ce travail de doctorat met en évidence la famille des Neisseriaceae comme un modèle important pour étudier la morphogenèse bactérienne, et identifie la perte de mraZ, l'insertion de amiC2 et les substitutions d'acides aminés sur MreB comme des événements importants associés à la transition de MuLDi à bacilli.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Veyrier, Frédéric
Mots-clés libres:	-
Centre:	Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt:	04 avr. 2024 16:17
Dernière modification:	04 avr. 2024 16:17
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/13555

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