Overcoming barriers to poor protein PEGylation efficiency.

Meziadi, Ahlem (2022). Overcoming barriers to poor protein PEGylation efficiency. Thèse. Québec, Doctorat en sciences de l'énergie et des matériaux, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, 234 p.

PDF Document sous embargo jusqu'à 8 mars 2025. Télécharger (20MB)

Résumé

Les protéines jouent le rôle le plus dynamique et le plus diversifié de toutes les macromolécules de l'organisme. Elles possèdent des structures chimiques complexes qui leur permettent de catalyser des réactions spécifiques, de servir d'échafaudages intracellulaires et extracellulaires, de se lier spécifiquement à des molécules cibles, de moduler les interactions protéiques, de transporter des molécules, d'éditer des gènes et de former des récepteurs et des canaux membranaires. Malgré ces fonctions primordiales, les protéines thérapeutiques présentent plusieurs limitations. En effet, celles-ci peuvent se replier en structures compactes et être rapidement éliminées du corps ou encore induire des réponses immunitaires (pour les protéines non humaines). En outre, les processus de fabrication, traitement, stockage et transport des protéines thérapeutiques pourraient avoir un impact sur leur stabilité et leur propension à l'agrégation. Des stratégies d'ingénierie visant à doter les protéines de propriétés de stabilité et de furtivité améliorées sont hautement souhaitables, et ces dernières années, des progrès considérables ont été réalisés pour prolonger la demi-vie et la stabilité des protéines en circulation. L'une des stratégies les plus étudiées pour atténuer la courte demi-vie et l'instabilité des protéines thérapeutiques a été de modifier les protéines avec du méthoxy poly (éthylène glycol) (mPEG), un processus appelé "PEGylation". Malgré l'utilisation intensive de la PEGylation pour modifier plusieurs molécules et biomolécules, les conditions de PEGylation ont très peu évolué au fil des ans. On sait très peu de choses sur la mauvaise efficacité et sa cause fondamentale. En général, pour surmonter le manque d'efficacité (faible rendement), la PEGylation implique la nécessité d'un excès important de réactif, ce qui augmente le coût, complique la purification et prend du temps. À notre connaissance, bien que les difficultés susmentionnées soient largement reconnues et généralement contournées par une optimisation empirique de base, très peu d'études ont examiné les causes plus fondamentales de la mauvaise efficacité de la PEGylation. Cette thèse est la première à démontrer et à caractériser les manifestations des interactions de déplétion au sein de solutions macroscopiquement homogènes dans le contexte de la PEGylation causées par l'effet de volume exclu (EVE) - résultant de la répulsion mutuelle du mPEG et des protéines en solution - conduisant à une mauvaise efficacité de la PEGylation. Des solutions pour améliorer l'efficacité globale de la PEGylation des protéines " chimiquement " en faisant varier les paramètres du solvant et " physiquement " en chauffant de manière transitoire à l'aide d'un réacteur à micro-ondes refroidi simultanément ont été développées. En utilisant des co-solvants de d’encombrement moléculaire tels que le mPEG-OH de faible poids moléculaire, il a été démontré que le phénomène de séparation des nanophases causé par l'EVE peut être traité. En particulier, la PEGylation totale de tous les résidus lysine accessibles au solvant sur certaines protéines a pu être réalisée en utilisant une quantité stœchiométrique de mPEG réactif aux protéines. De même, le chauffage transitoire généré par l'irradiation par micro-ondes accélère considérablement la vitesse de PEGylation de plusieurs protéines par alkylation réductrice. Une preuve de concept a été produite, démontrant que le chauffage transitoire peut être exploité dans la chimie en flux. Par ailleurs, d'autres réactions et phénomènes impliquant la communication protéine-protéine et protéine-substrat ont été explorés. En tirant parti des connaissances développées sur les systèmes PEG-protéines, il a été démontré que l'encombrement moléculaire à l'aide de mPEG de faible poids moléculaire augmentait significativement l'activité de glucose oxydase, favorisant ainsi les interactions enzyme-substrat par EVE.

Proteins play the most dynamic and diverse role of all macromolecules in the body. They have complex chemical structures that allow them to catalyze specific reactions, serve as intracellular and extracellular scaffolds, bind specifically to target molecules, modulate protein interactions, transport molecules within a cell or from one organ to another, edit genes, and form receptors and membrane channels. Despite these advantages, therapeutic proteins still suffer from limitations. In particular, they can fold into compact structures and rapidly eliminated from the body, and non human proteins can induce immune responses. In addition, several stresses can occur during the manufacturing, processing, storage, and transport of therapeutic proteins that can impact their stability and propensity towards aggregation. Engineering strategies to endow proteins with improved stability and stealth properties are highly desirable, and in recent years considerable progress has been made in extending the half-life and stability of proteins in circulation. One of the most studied strategies to mitigate the short half-life and instability of therapeutic proteins has been to modify the proteins with methoxy poly (ethylene glycol) (mPEG), a process called "PEGylation". Despite the extensive use of PEGylation to modify several molecules and biomolecules, the conditions of PEGylation over the years have remained virtually unchanged. Very little is known about poor efficiency and its fundamental cause. Generally, to overcome the poor efficiency (low yield), PEGylation implies the need for a significant excess of reactant, driving up the cost, complicating purification, and is time-consuming. To the best of our knowledge, while the challenges above are widely recognized and generally circumvented by basic empirical optimization, very few studies have investigated the more fundamental causes for poor efficiency of PEGylation. This thesis is the first to demonstrate and characterize the manifestations of depletion interactions within macroscopically homogeneous solutions in the context of PEGylation caused by the excluded volume effect (EVE) – resulting from the mutual repulsion of mPEG and proteins in solution – leading to poor PEGylation efficiency. Solutions for improving the overall efficiency of protein PEGylation ‘chemically’ by varying solvent parameters and ‘physically’ by transient heating using a simultaneously cooled microwave reactor were developed. By using molecular crowing co-solvents such as low molecular weight mPEG-OH, it has been shown that the nanophase separation phenomenon caused by EVE can be addressed. In particular, full PEGylation of all solvent-accessible lysine residues on certain proteins could be achieved using a stoichiometric amount of protein-reactive mPEG. Similarly, transient heating generated by microwave irradiation significantly accelerates the rate of PEGylation of several proteins by reductive alkylation. A proof-of-concept was produced demonstrating that transient heating can be exploited in flow chemistry. In addition, besides PEG-proteins, other reactions and phenomena involving protein-protein and protein-substrate communication were explored. Taking advantage of the knowledge developed on PEG-protein systems, it was shown that molecular crowding using low molecular weight mPEG significatively increased glucose oxidase activity, therefore promoting enzyme-substrate interactions through EVE.

Type de document:	Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse:	Gauthier, Marc A.
Mots-clés libres:	protéines; polyéthylène glycol; PEGylation; volume exclu; interactions de déplétion; micro-ondes; interaction protéine-protéine; interaction protéine-substrat; proteins; polyethylene glycol; excluded volume; depletion interactions; Microwave; protein-protein interaction; protein-substrate interaction
Centre:	Centre Énergie Matériaux Télécommunications
Date de dépôt:	31 août 2023 13:56
Dernière modification:	31 août 2023 13:56
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/13546

Gestion Actions (Identification requise)

Modifier la notice