Impact du transactivateur vp16 du virus herpès simplex 1 sur la protéine cellulaire upstream binding factor

Alfonsi, Gauthier (2022). Impact du transactivateur vp16 du virus herpès simplex 1 sur la protéine cellulaire upstream binding factor Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, mémoire en en virologie et immunologie, 60 p.

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Résumé

Le virus herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus ADN double brin qui infecte les cellules épithéliales et neuronales humaines. Notre laboratoire a découvert que l'infection par HSV-1 déclenche la relocalisation de plusieurs protéines nucléolaires, dont Upstream Binding Factor (UBF), un facteur de transcription de l'ARN polymérase I pouvant également être impliqué dans la stimulation de la transcription de l’ARN polymérase II. UBF se relocalise des nucléoles aux compartiments de réplication virale et colocalise avec l'ADN viral. Nous avons montré que UBF inhibe la réplication de HSV-1. La protéine virale structurale VP16 fait partie du tégument de HSV-1, une couche entre la capside et l'enveloppe du virus qui est constituée de protéines virales et cellulaires pouvant agir avant la décapsidation et l'expression des gènes viraux. VP16 est un facteur de transcription des gènes viraux immédiats-précoces qui recrute une série de facteurs de transcription aux promoteurs viraux via son domaine d'activation acidique. Des résultats préliminaires suggèrent que VP16 peut affecter la colocalisation de UBF avec l'ADN viral. Nous émettons l'hypothèse que VP16 inhibe l'activité antivirale de UBF. Premièrement, nous avons étudié si le domaine transactivateur de VP16 interagit avec UBF. Les protéines recombinantes glutathion S-transférase (GST) et GST fusionné au domaine transactivateur de VP16 (GST-VP16AD) ont été exprimées en bactérie et immobilisées sur des billes glutathion-sépharose. Un extrait de protéines cellulaires totales a été préparé à partir de cellules HeLa. Cet extrait a été traité avec de la nucléase micrococcale pour dégrader les acides nucléiques et empêcher ces derniers de médier des interactions non spécifiques entre le domaine transactivateur de VP16 et UBF. Nous avons testé si UBF de l'extrait cellulaire interagissait spécifiquement avec le domaine d'activation de VP16 dans un essai d'interactions protéines-protéines de type « GST pull-down ». Nous avons élué les protéines adsorbées aux matrices d'affinité, puis nous avons fait un immunobuvardage ciblant UBF. Nous avons également réalisé un contrôle positif en ciblant par immunobuvardage TATA box binding protein (TBP). En effet, TBP est recruté par le domaine transactivateur de VP16, et notre hypothèse suggère qu’il existe une interaction entre ce domaine de VP16 et UBF. Nous avons détecté TBP dans l’extrait de protéines cellulaires totales ainsi que dans les éluats de billes, plus intensément pour GST-VP16AD que pour GST. UBF a été détecté dans l'extrait de protéines cellulaires totales mais pas dans les éluats, ce qui suggère que UBF ne se lie pas au domaine transactivateur de VP16 en absence d'autres protéines virales. Deuxièmement, nous avons cherché à déterminer si la surexpression de VP16 module la localisation intracellulaire de UBF. Nous avons généré des vecteurs permettant de surexprimer VP16 pleine longueur et une version mutée de VP16 avec une délétion C-terminale des acides aminés 423 à 490 qui enlève le domaine de transactivation. L'expression de VP16 avec et sans domaine de transactivation en contexte de transfection transitoire de cellules HeLa a été validé par immunobuvardage de protéines. Nous avons transfecté de manière transitoire des cellules HeLa pour surexprimer UBF seule, VP16 seule, ou pour surexprimer simultanément UBF et VP16. Les cellules ont été traitées pour visualiser les protéines VP16 et UBF par immunofluorescence indirecte au microscope confocal. VP16 exprimé de manière ectopique est détecté principalement dans le cytoplasme. Nous avons constaté qu'en surexprimant uniquement UBF, la protéine est principalement détectée dans le noyau. En revanche, en surexprimant simultanément VP16 pleine longueur, une grande portion de UBF est détectée dans le cytoplasme. Un résultat préliminaire suggère que UBF soit également localisée majoritairement dans le cytoplasme quand les cellules surexpriment simultanément une version mutée de VP16 sans domaine transactivateur. Nos résultats montrent que la surexpression de VP16 peut affecter la localisation intracellulaire de UBF en absence d'autres protéines virales. Bien que UBF endogène ne soit pas relocalisé au cytoplasme en contexte d'infection, ces résultats suggèrent que UBF et VP16 puissent interagir. Le domaine de transactivation de VP16 est connu pour interagir avec plusieurs facteurs de transcription afin de moduler l'activité transcriptionnelle de l'ARN polymérase II. Néanmoins, l'effet de VP16 sur la localisation intracellulaire de UBF exprimée de manière ectopique ne semble pas dû à l'interaction du domaine d'activation de VP16 avec celle-ci. Cela suggère que VP16 pourrait affecter la localisation de UBF dans la cellule hôte via une interaction médiée par une partie de la protéine autre que le domaine de transactivation. Des travaux futurs pourront élucider le domaine de VP16 nécessaire pour cette interaction, ainsi que l'impact fonctionnel de cette interaction.

Herpes simplex virus (HSV-1) is a double-stranded DNA virus that infects human epithelial and neuronal cells. Our laboratory found that HSV-1 infection triggers the relocalization of several nucleolar proteins, including Upstream Binding Factor (UBF), an RNA polymerase I transcription factor that may also be involved in the stimulation of RNA polymerase II transcription. UBF relocalizes from nucleoli to viral replication compartments and colocalizes with viral DNA. We have shown that UBF inhibits HSV-1 replication. The viral structural protein VP16 is part of HSV-1 tegument, a layer between the capsid and the envelope of the virus, which is composed of viral and cellular proteins that can act prior to decapsidation and viral gene expression. VP16 is an immediate-early viral transcriptional activator that recruits various transcription factors to viral promoters via its acidic activation domain. Preliminary results suggest that VP16 may affect the colocalization of UBF with viral DNA. We hypothesize that VP16 inhibits the antiviral activity of UBF. Firstly, we studied if the transactivator domain of VP16 interacts with UBF. Recombinant glutathione S-transferase (GST) and GST fused with the transactivation domain of VP16 (GST-VP16AD) were expressed in bacteria and immobilized on glutathione-sepharose beads. A whole cell protein extract was prepared from HeLa cells. This extract was treated with micrococcal nuclease to degrade nucleic acids and prevent them from mediating nonspecific interactions between UBF and the transactivation domain of VP16. We tested if UBF from the whole cell extract interacted specifically with the activation domain of VP16 in a GST pull-down assay. We eluted proteins that were adsorbed to GST and GST-VP16 affinity matrices and then performed a western blot targeting UBF. We also included a positive control by testing for TATA box binding protein (TBP). Indeed, TBP is known to be recruited by the transactivation domain of VP16, and our hypothesis suggests that there is an interaction between this domain of VP16 and UBF. We detected TBP in the whole cell extract as well as in the eluates of the affinity beads, more intensely for GST-VP16AD than for GST. UBF was detected in the whole cell extract but not in the eluates, suggesting that UBF does not bind to the transactivation domain of VP16 in the absence of other viral proteins. Secondly, we tested if overexpression of VP16 modulates the intracellular localization of UBF. We generated vectors to overexpress full-length VP16 and a mutated version of VP16 with a C-terminal deletion of amino acids 423 to 490 that removes the transactivation domain. Expression of VP16 with and without transactivation domain in the context of transient transfection of HeLa cells was validated by western blot. We transiently transfected HeLa cells to overexpress UBF alone, VP16 alone, or to simultaneously overexpress UBF and VP16. Cells were treated to visualize VP16 and UBF by indirect immunofluorescence using a confocal microscope. Overexpressed VP16 was detected mainly in the cytoplasm. When UBF was overexpressed alone, we found that it was localized mainly in the nucleus. In contrast, when UBF was simultaneously overexpressed with full-length VP16, a large portion of UBF was detected in the cytoplasm. A preliminary result suggests that UBF was also localized mainly in the cytoplasm when cells overexpressed simultaneously a mutated version of VP16 without a transactivation domain. Our results show that overexpression of VP16 can affect the intracellular localization of UBF in the absence of other viral proteins. Although endogenous UBF is not relocalized to the cytoplasm in the context of infection, these results suggest that UBF and VP16 may interact. The transactivation domain of VP16 is known to interact with several transcription factors in order to modulate the transcriptional activity of RNA polymerase II. Nevertheless, the effect of VP16 on the intracellular localization of ectopically expressed UBF does not seem to be mediated by an interaction with the activation domain of VP16. This result suggests that VP16 could affect the localization of UBF in the host cell via an interaction mediated by a domain other than the transactivation domain. Future work may identify the domain of VP16 required for this interaction, as well as the functional impact of this interaction.

Type de document:	Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse:	Pearson, Angela
Mots-clés libres:	Virus herpès simplex ; défense antivirale ; échappement viral ; relation hôte-virus ; VP16 ; UBF; Herpes simplex virus; antiviral defense; viral escape; host-virus relation
Centre:	Institut national de la recherche scientifique
Date de dépôt:	18 juill. 2023 14:08
Dernière modification:	18 juill. 2023 14:08
URI:	https://espace.inrs.ca/id/eprint/13060

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