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Nanoscale phenomena influencing phage-displayed enzymes and emerging technologies to analyze activity towards complex substrates.

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Nahar, Sharifun (2021). Nanoscale phenomena influencing phage-displayed enzymes and emerging technologies to analyze activity towards complex substrates. Thèse. Québec, Doctorat en sciences de l'énergie et des matériaux, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, 174 p.

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Résumé

Dans certains cas, l'utilisation d'enzymes est confrontée à des défis tels que l'instabilité dans des conditions extrêmes, la purification des produits intermédiaires de chaque étape d'une réaction à plusieurs étapes, ou même la recherche de la technologie appropriée pour suivre la réaction de manière prédominante lorsque l'échantillon ou la matière première sont complexes. Pour répondre à ce besoin, en plus de l'ingénierie des enzymes, l’immobilisation sur un support solide est devenue un standard, bien que les tendances récentes soient plus axées sur l'ingénierie du microenvironnement. Dans cette thèse, nous avons exploré l'effet modélisé du phage sur l'activité enzymatique. Nous avons évalué l'effet des paramètres de la solution sur l'activité catalytique de la lipase A de Bacillus subtilis (BSLA) affichée par le phage. Alors que les profils d'activité en fonction du pH et de température de la BSLA n'étaient pas affectés par l'affichage du phage, la distribution à l'échelle nanométrique de la BSLA dans le tampon d'essai micellaire l'était. Cela a causé une augmentation prononcée de l'activité du phage-BSLA par rapport à l'enzyme libre, en raison de l'accumulation du phage-BSLA dans les micelles riches en substrat. Compte tenu de ce résultat, il convient de faire attention lors de la sélection d'autres enzymes/protéines par affichage phagique, car l'activité de la protéine affichée peut différer de celle de la protéine libre. Ensuite, la glucose oxydase et la peroxydase de raifort ont été immobilisées sur la protéine d'enveloppe majeure P8 du phage-BSLA, ces trois enzymes effectuant ensemble une réaction en cascade. Puis, les phages ont été réticulés par des interactions biotine-streptavidine, ce qui semble créer un microenvironnement différent autour des enzymes. Nos résultats indiquent que la cascade de trois enzymes, BSLA→GOx→HRP, peut en effet être améliorée par rapport aux enzymes libres en solution par la fixation d'un modèle sur un phage. En fin de compte, cette étude de preuve de concept suggère que les systèmes de cascade d'enzymes modélisés par des phages peuvent être des plateformes prometteuses pour la fabrication écologique, bien que la prédiction de l'effet du microenvironnement sur toutes les enzymes reste un défi. Enfin, nous avons étudié la technologie d'émission terahertz (THz) pour le suivi sans étiquette des changements chimiques. Les réactions enzymatiques sont généralement surveillées à l'aide de substrats de substitution qui produisent des signaux optiques quantifiables. Dans cette étude, la technologie d'émission THz est utilisée comme une technique non invasive et sans marqueur pour surveiller la cinétique de l'hydrolyse induite par la lipase de plusieurs molécules de substrat (y compris le substrat complexe qu'est le lait de vache entier) et l'oxydation catalysée par la peroxydase de raifort de l'o-phénylènediamine en présence de peroxyde d'hydrogène. Cette technique s'est avérée quantitative, et les paramètres cinétiques sont comparés à ceux obtenus par spectroscopie RMN des protons ou par spectroscopie UV/Vis. Cette étude ouvre la voie à l'étude de la technologie d'émission THz en tant qu'outil de recherche et de développement impliquant des enzymes.

Abstract

The use of enzymes, in some cases, face challenges due to less stability towards extreme condition, purification of intermediate products from each step of a multistep reaction or even finding the appropriate technology to follow the reaction predominantly when the sample is complex or raw material. To overcome this need, in addition of doing enzyme engineering, enzyme immobilization on solid support has become standard though the recent trends are more focused towards enzyme’s microenvironment engineering. In the second chapter of this thesis, we explored the templated effect of phage on enzyme activity. We evaluated the effect of solution parameters on the catalytic activity of phage displayed Bacillus subtilis Lipase A (BSLA). While the pH and temperature-activity profiles of BSLA were not intrinsically affected by phage display, the nanoscale distribution of BSLA within the micellar assay buffer was. This causes a pronounced increase of activity of phage–BSLA relative to the free enzyme, due to the accumulation of phage–BSLA at the substrate-rich micelles. Considering this result, attention should be taken and similar effects should be considered when selecting other enzymes/proteins by phage display, as the activity of the displayed protein may differ from that of the free protein. Then, we explored the potential of nanoscale distribution of multi-enzyme templated phage. We immobilized glucose oxidase and horseradish peroxidase onto the p8 major coat protein on the M13 phage that already displayed BSLA on its p3 coat protein. These three enzymes together perform a cascade reaction. We explored whether this model three-enzyme cascade system, yields an advantageous acceleration of the overall reaction relative to the free enzymes in solution. Phages were crosslinked by biotin–streptavidin interactions, which appeared to create a more favorable microenvironment. Our result indicated that the three-enzyme cascade, BSLA GOx HRP, can indeed be enhanced compared to the free enzymes in solution by templating on a phage. Ultimately, this proof-of-concept study suggests that phage-templated enzyme cascade systems may be promising platforms for green manufacturing, though predicting the effect of microenvironmental effects on all the enzymes remains a challenge. Later, we investigated terahertz (THz) emission technology for label-free monitoring of chemical changes. Enzymatic reactions are typically monitored using surrogate substrates that produce quantifiable optical signals. In this study, THz emission technology is used as a non-invasive and label-free technique to monitor the kinetics of lipase-induced hydrolysis of several substrate molecules (including the complex substrate whole cow’s milk) and horseradish peroxidase catalyzed oxidation of o-phenylenediamine in the presence of hydrogen peroxide. This technique was found to be quantitative, and kinetic parameters are compared to those obtained by proton NMR spectroscopy or UV/Vis spectroscopy. This study sets the stage for investigating THz emission technology as a tool for research and development involving enzymes, and for monitoring industrial processes in the food, cosmetic, detergent, pharmaceutical, and biodiesel sectors.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Gauthier, Marc A.
Mots-clés libres: affichage de phages ; Enzyme ; lipase A de Bacillus subtilis (BSLA) ; micelles de substrat ; cascade d'enzymes ; réticulation ; microenvironnement ; glucose oxydase ; peroxydase de raifort ; lipase B de Candida antarctica (CALB) ; émission térahertz ; lait; phage display; enzyme; Bacillus subtilis lipase A (BSLA); substrate micelles; enzyme cascade; crosslinking; microenvironment; glucose oxidase; horseradish peroxidase; Candida antarctica lipase B (CALB); terahertz emission; milk
Centre: Centre Énergie Matériaux Télécommunications
Date de dépôt: 01 avr. 2022 14:04
Dernière modification: 01 avr. 2022 14:04
URI: https://espace.inrs.ca/id/eprint/12554

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