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Développement d’une méthode de suivi de la densité cellulaire d’une culture de diatomées périphytiques (Nitzschia palea) par spectrofluorimétrie.

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Robinson, Christophe (2021). Développement d’une méthode de suivi de la densité cellulaire d’une culture de diatomées périphytiques (Nitzschia palea) par spectrofluorimétrie. Rapports Techniques. INRS-ETE, Québec.

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Résumé

Les méthodes de comptage classiques (compteur de particule, cytomètre en flux, cellule de Nageotte) comportent des inconvénients pour la mesure de la densité cellulaire des diatomées périphytiques comme Nitzschia palea. Ces inconvénients sont liés au mode de vie adsorbé aux surfaces et/ou en amas de ces organismes, ce qui demande des remises en suspension longues et fastidieuses. Or, d'autres méthodes comme le Phyto-PAM utilisent le principe de fluorescence in vivo de la chlorophylle a pour l'étude du phytoplancton. D'où l'objectif de développer une méthode de suivi de la densité cellulaire de Nitzschia palea par spectrofluorimétrie in vivo. Pour ce faire, des spectres d'émission ont été réalisés afin de déterminer les longueurs d'ondes d'excitation optimales de la chlorophylle a. Cette étape a abouti à la sélection d'un couple excitation/émission de 436 et 680 nm. Ce couple de longueurs d'onde a pu être testé pour déterminer la fluorescence in vivo d'échantillons issus de trois séries de dilution. En parallèle, un comptage cellulaire a été effectué au compteur de particules et une mesure de la fluorescence de la chlorophylle a de chaque échantillon extraite dans l'acétone ont été réalisés pour compléter les résultats. Ils ont montré une forte relation de proportionnalité entre la densité cellulaire des échantillons et leur intensité de fluorescence in vivo, mais également la concentration de chlorophylle a extraite. Cette relation permet donc l'utilisation de l'équation de droite pour estimer l'évolution de la densité cellulaire d'une culture à partir de son simple signal de fluorescence in vivo. Enfin, pour mieux comprendre l'influence des contenant (verre, plastique) et des conditions de culture (agitation ou non) sur la croissance de Nitzschia palea, un suivi de croissance sur 9 jours a été effectué dans des erlenmeyers en verres agités (condition EA) et des cuvettes plastiques agitées (CA) et non agitées (CNA). Les résultats obtenus ont été assez hétérogènes et ont montré que la densité cellulaire mesurée variait fortement (plusieurs phases de décroissance) au cours du temps pour la condition EA, de même pour les densités cellulaires estimées des autres conditions. Il est apparu que les densités mesurées en fin de suivi n'étaient pas significativement différentes entre CA et EA et les densités mesurées/estimées EA. Enfin les densités cellulaires mesurées pour les trois conditions en toute fin de suivi n'ont pas montré de différences significatives, ce qui laisse penser que la croissance des diatomées dans les cuvettes est relativement bonne. De plus, et bien que ce résultat ne soit pas démontré statistiquement, il semble également que les diatomées croissent mieux dans un milieu non-agité, qui reproduirait davantage les conditions naturelles de leur milieu de vie. Finalement, il serait intéressant de réaliser de nouvelles expériences de comparaison intensité de fluorescence in vivo et densité cellulaire afin de consolider la relation mise en évidence au cours du projet. Ceci afin de pouvoir faciliter la réalisation de suivis de la densité cellulaire de Nitzschia palea dans le cadre d'expositions à des contaminants.

Abstract

Usual cell counting methods (particle counter, flow cytometer, Nageotte cell) are not totally adapted for periphytic diatom cell density measurements. Nitzschia palea tends to live in aggregates or adsorbed to a substrate, which can be the flask wall. As a consequence, long and tedious stirs are needed in order to obtain an acceptably homogenous suspension. However, there are other methods like Phyto-PAM that uses in vivo fluorescence of chlorophyll a to study phytoplankton. Hence, we aimed to develop a fluorescence spectroscopy based method to measure Nitzschia palea cell density. To this end, emissions spectra have been conducted to determine best chlorophyll a molecule excitation wavelengths. This step has led to retain 436 and 680 nm as excitation and emission wavelengths respectively. These parameters were used afterwards, in order to determine in vivo fluorescence of samples from three dilution series. In parallel, a cell count was performed using a particle counter and a fluorescence measurement of the extracted chlorophyll a was also determined for each sample to complete the results. This work has led to the determination of a proportionality relationship between cell density measurements and chlorophyll a fluorescence intensities (extracted and in vivo), using a linear regression model. Thus, this relation allows using this equation to estimate cell density evolution of a culture using only its fluorescence signal. Then, to better understand the influence that both culture containers and conditions might have on Nizschia palea’s growth, cell density has been measured along a 9 day culture period in stirred glass erlenmeyers (EA condition), stirred plastic cuvettes (CA) and non-stirred plastic cuvettes (CNA). The results obtained were quite heterogeneous and showed that cell density was fluctuating strongly over time for the EA condition as well as for other conditions for estimated cell density. It appears that CA and EA cells densities measured and estimated at the end of this monitoring were not statistically different. Finally, cell densities measured at the end of the experiment for each condition have not shown any significant differences, suggesting that diatoms grow as well in cuvettes as they do in Erlenmeyer flasks. Moreover, it seems that their growth might be better in a non-stirred environment, which would be similar to their natural way of living. Eventually, it would be interesting to carry further experiments to compare, once again, cell density and in vivo fluorescence and strengthen the mathematical relationship that has been established during this project. This would facilitate Nitzschia palea cell density monitoring during contaminant exposures.

Type de document: Monographie (Rapports Techniques)
Mots-clés libres: diatomées; spectrofluorimétrie; chlorophylle a; densité cellulaire; diatoms; fluorescence spectroscopy; cell density
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 19 oct. 2021 20:06
Dernière modification: 19 oct. 2021 20:06
URI: https://espace.inrs.ca/id/eprint/12061

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