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Interactions moléculaires entre la protéine P1 et l'ARN du virus de la mosaïque du navet (TuMV).

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Soumounou, Youssouf (1994). Interactions moléculaires entre la protéine P1 et l'ARN du virus de la mosaïque du navet (TuMV). Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 169 p.

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Résumé

Depuis ces dernières années, l'on assume que la propagation des virus de cellule à cellule, dans les plantes infectées, est un processus actif se faisant par le passage du génome viral ou du virion à travers les voies naturelles intercellulaires que constituent les plasmodesmes. L'on estime également que ce passage, via les canaux du plasmodesme, serait facilité grâce à la participation active de protéines spécifiques codées par le virus et appelées protéines de mouvement. Cependant, les mécanismes par lesquels ces protéines opèrent ne sont pas encore élucidés.

Une implication hypothétique de la protéine Pl, située à l'extrémité Nterminale de la polyprotéine des potyvirus, dans le mouvement de cellule à cellule, est de plus en plus évoquée. Ce rôle prépondérant de la Pl dans le mouvement local suppose qu'elle pourrait interagir directement avec l'ARN viral pour former un complexe ribonucléoprotéique transportable.

Dans le but d'une caractérisation moléculaire de la protéine Pl du virus de la mosaïque du navet (TuMV), et afin d'évaluer sa capacité à lier les acides nucléiques in vitro, nous avons décidé de l'exprimer dans Escherichia coli. Pour ce faire, nous avons amplifié le gène de la Pl par la technique de la polymérisation en chaine (PCR) utilisant l'ADN polymérase de la bactérie Thermus aquaticus (Taq DNA polymerase). Le gène amplifié a ensuite été cloné dans un vecteur d'expression pET-2ld, et ceci nous a permis d'obtenir un plasmide recombinant appelé pET-Pl. Ce plasmide recombinant a ensuite été introduit dans E. coli BL-2l(DE3), et l'expression de la Pl recombinante a été induite et analysée par séparation électrophorétique des protéines bactériennes en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SOS-PAGE) suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. Les bactéries BL-21(DE3) transformées et exprimant la Pl ont été numérotées souche 408. La Pl a été surexprimée dans la souche 408, purifiée par chromatographie d'affinité sur résine au nickel dans des conditions dénaturantes, et ensuite renaturée par dialyse contre de l'eau. Des expériences de gel de retardement ont démontré que la Pl était capable de lier une sonde ARN radiomarquée de manière coopérative. Nous avons fait des essais de liaison-croisée par la lumière UV («UV light cross-linking») afin de nous assurer que les liaisons observées n'étaient pas dues à des artéfacts expérimentaux ou à des contaminants de E. coli. La liaison Pl-ARN était spécifique puisque les complexes formés étaient stables dans des concentrations relativement élevées de sels (Na Cl et KCI). Au cours de tests de compétition, nous avons pu déterminer que la Pl avait la capacité de lier les acides nucléiques simple brin ADN et ARN, avec une affinité similaire et en apparence d'une manière séquence-indépendante, mais pas l'ADN bicaténaire. La Pl de TuMV possède la caractéristique particulière de lier l'ARN double brin avec une affinité similaire à celle des acides nucléiques simple brin.

Nous avons identifié dans la Pl un domaine très riche en acides aminés basiques, compris entre les résidus 150 et 168, qui possède un potentiel d'interactions avec les acides nucléiques; et ce domaine présente beaucoup d'homologies avec certaines protéines virales capables de lier l'ARN. Ce domaine pourrait être impliqué dans les interactions Pl-ARN.

L'abondante expression de la Pl dans la souche 408, nous a également permis de produire des anticorps polyclonaux anti-Pl chez des lapins. La spécificité de l'anticorps a été déterminé par immunobuvardage. Cet anticorps anti-Pl devra servir ultérieurement à la détection et à la localisation intracellulaire de la protéine dans les cellules de plantes infectées par TuMV.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Laliberté, Jean-François
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 08 août 2019 01:58
Dernière modification: 08 août 2019 01:58
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8224

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