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Biotransformation du glycérol brut en lipides par microorganismes hétérotrophes (levures) pour la production de biodiésel.

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Mathiazhakan, Kuttiraja (2016). Biotransformation du glycérol brut en lipides par microorganismes hétérotrophes (levures) pour la production de biodiésel. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 461 p.

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Résumé

La recherche de nouvelles sources énergétiques représente une voie d’étude importante au regard des problèmes environnementaux liés à la forte consommation d’énergie fossiles (huiles lourdes, essence, diesel, gaz, etc.). Il s’agit aujourd’hui de mettre en oeuvre des matières premières ou d’énergies renouvelables obtenues à partir de biomasse d'origine végétale, animale ou suite à de nouvelles transformations chimiques. Dans ce contexte, les huiles issues de microorganismes oléagineux produits à partir de ressources renouvelables comme le glycérol, les huiles végétales, les déchets agro-résiduels, déchets solides et liquides municipaux, les résidus forestiers et autres déchets industriels couvrant une richesse organique, pouvant être microbiologiquement assimilable, représentent des avenues potentielles. Actuellement, divers carburants renouvelables principalement le bioéthanol sont produits à partir de mélasses ou d'autres sucres fermentescibles facilement disponibles. Par ailleurs, la synthèse de lipides microbiens constitue un mécanisme biologique fondé et bien connu notamment de par la production industrielle des TAGs (Triacylglycérols). Ces microorganismes possèdent un large éventail de propriétés physiologiques et métaboliques pour l’utilisation de substrats multiples. Les microbes oléagineux accumulent des lipides intracellulaires variant de 20 à 85% (p/p) de la biomasse cellulaire totale sèche. Compte tenu de ces propriétés avantageuses, le glycérol ainsi que certains déchets agro-industriels font l’objet d’études comme sources de carbone ou substrats assimilables pour la production de lipides. Des échantillons de sol prélevés à partir de milieux forestiers vierges et autres sols contaminés par des déversements accidentels de glycérol ont été sélectionnés et reproduits dans des milieux de cultures sélectifs supplémentées de glycérol. Des souches de bactéries, de levures et des champignons filamenteux sont apparus dans les 48h suivant l'incubation et ont été acheminés pour des analyses plus poussées. Tous les isolats ont été cultivés dans du glycérol brut (GB) enrichi avec une limitation d’azote pendant 120h. Les cellules récoltées après incubation ont été colorées avec le Soudan noir B et observées au microscope à contraste de phases. Les organismes ayant révélés des globules d'huile en observation microscopique sur lame fixe, ont été sélectionnés pour un criblage secondaire subséquent. Tous les organismes ont été initialement identifiés par Biolog suivi de séquençage (ADNr 18S). Dans le criblage secondaire, une concentration GB de 100 g/L et deux différents ratios molaires C/N ont été choisis. La fermentation a été menée jusqu'à 120h après l’inoculation des souches. Sur la base des résultats obtenus, la souche SKY7 (teneur en lipides de 45% en p/p) a été sélectionnée pour les étapes subséquentes. SKY7 a été identifiée comme Yarrowia lipolytica par la méthode biochimique et génomique via le séquençage d’ADNr 18S. Cette souche est bien connue comme oléagineuse, elle est aussi dotée de la production d’acide citrique et surtout capable d'utiliser une large gamme de substrats. Par ailleurs, les paramètres de culture ont été évalués pour Y.lipolytica SKY7 afin d'obtenir une production optimisée en lipides intracellulaires. Les expériences menées en erlenmeyer à petite échelle initiale ont été réalisées à différentes concentrations de glycérol, rapport molaire C/N, taille de l'inoculum, et concentrations en oligo-éléments. Les meilleurs résultats (en termes de concentrations en biomasse et de lipides accumulés) ont été enregistrés avec une concentration en glycérol de 100 g/L et un ratio C/N de 100. Relativement aux résultats obtenus, la fermentation a été effectuée à plus grande échelle (réacteur de 15L de capacité totale avec un volume utile de 11L) en utilisant 100 g/L de glycérol, un rapport C/N molaire de 100 et 5% v/v d’inoculum et ce, sous 2 angles comparatifs : avec et sans contrôle du pH. La synthèse de lipides a été globalement observée entre 30 et 60h. Dans le cas des expériences à pH contrôlé, des concentrations en lipides (43,2% p/p) de 7,78g /L avec une biomasse de 18 g/L ont été atteintes. Même dans l’éventualité de résultats similaires en biomasse durant la fermentation, la condition de pH non contrôlé démontre des concentrations significativement plus faibles en lipides par rapport aux résultats d’expériences à pH contrôlé. Par conséquent, on conclut que le contrôle du pH pourrait améliorer la synthèse des lipides pendant la fermentation. De plus, à partir des résultats expérimentaux, on a supposé à partir de la littérature qu’Y.lipolytica SKY7 exigeait un rapport C/N molaire entre 350-400 pour son métabolisme en phase lipogénique. Le maintien du rapport molaire C/N dans l’intervalle indiqué étend la phase lipogénique et permet d’améliorer le rendement global de production en lipides. La présente étude met en oeuvre le potentiel de production de lipides par Y.lipolytica SKY7 à partir d’un milieu synthétique à base de GB. Afin de maximiser la concentration en lipides et en biomasse, la méthode de plan d’expérience Box-Behnken a été adoptée et les principaux paramètres étudiés étaient les suivants : concentration de glycérol, rapport molaire C/N et volume de l'inoculum. Des concentrations de biomasse de 29,5 g /L et 50% (p/p) de lipides ont été enregistrés dans les conditions optimales (concentration de glycérol 82,5 g/L et de rapport C/N 75 avec un inoculum à 6,25% v/v). Afin d'améliorer la production en lipides à partir de microorganismes hétérotrophes, une approche alternative permettant de substituer les nutriments commerciaux a été retenue. Des sources d’azote organique et inorganique ont été ainsi remplacées par des lixiviats de silos de stockage de grains et les principaux résultats ont dévoilé qu’il s’agit d’une perspective plausible pour l’utilisation de déchets à faible coût comme source nutritive pour la synthèse de lipides microbiens. Cette approche d’utilisation de déchets à faible coût permet de démontrer l’intérêt économique et environnemental de la technologie proposée en tenant compte de trois points principaux : 1) diminution de coût de procédé ; 2) contribution à la protection de l'environnement par l'élimination des nutriments à partir de flux de déchets nuisibles et ; 3) valeur ajoutée des flux de déchets a un avantage en vue de la valorisation. En outre, les études menées à l'échelle du fermenteur (15L) avec des ajouts de lixiviats de silos (200ml/L) ont donné lieu à une biomasse et des lipides de concentrations de 25,82 et de 15,15g/L, respectivement au bout de seulement 51h de fermentation. Les rendements de la biomasse et des lipides ainsi obtenus sont de 83,45g/mol C et 53,28g/ C mol avec une teneur en lipides de 63,85% en p/p de la masse cellulaire sèche. Toutefois, le remplacement de la source nutritive seule ne peut pas rendre le processus économiquement viable. Les conditions opérationnelles influencent vigoureusement l'économie du processus. La stérilisation des réacteurs et des milieux composants est une étape exigeante en manipulations et à haute demande en énergie. Ainsi, en éliminant cette opération, on pourrait accroître l'économie globale du procédé pour une faisabilité plus probable. Un procédé dit non stérile en présence de méthanol a été étudié pour éliminer le processus de stérilisation. Les premiers résultats obtenus à partir des expériences en erlenmeyer ont démontré une accumulation de biomasse de 9,8 g/L avec une teneur en lipides de 48% p/p quand on rajoute 3% de méthanol (v/v). Cependant, lorsque des conditions analogues ont été reproduites à l’échelle de bioréacteur, la fermentation contrôlée relevant de ce procédé a échoué (contamination observée) après 18h du début de la fermentation. Par conséquent, une autre approche alternative a été formulée. Un traitement UV d’une durée de 10 minutes a été introduit pour traiter l'eau du robinet avant son ajout comme eau de procédé servant à la dilution du milieu de culture. Grâce à ce traitement aux UV avec une addition de 3% (v/v) de méthanol, nous avons pu retarder l’apparition de la contamination jusqu’à 42h après le début de la fermentation. Il en résultait une biomasse élevée (17,57g/L) et une concentration de lipides (8,8 g/L) non négligeable via ce processus non stérile. En comparaison avec la condition expérimentale précédente (3% v/v de méthanol seul) la biomasse et la concentration des lipides ont été améliorés par des facteurs de 3 et 4, respectivement. Afin d'améliorer l'accumulation de lipides à l’intérieur des cellules microbiennes, une approche biochimique a été expérimentée. Une série de concentrations différentes en biotine (10, 50 et 100 μg/L), ajoutée en supplément au milieu de fermentation établi (précédemment) a été étudiée. En général, la biotine est l'un des facteurs de croissance importants et nécessaires pour la synthèse des lipides membranaires (paroi cellulaire). En outre, la biotine renferme un groupement prosthétique principal (ACC- l'acétyl-CoA carboxylase) agissant par la carboxylation de l'acétyl-CoA en malonyl-CoA pour la synthèse des TAGs. Des travaux antérieurs sur l’ajout de biotine ont été rapportés pour améliorer la production d'acides gras à longue chaîne. Dans le cas présent, l'addition de 100 μg/L de biotine a notamment amélioré la concentration de lipides dans des cultures en batch de Y. lipolytica. Par rapport aux conditions de contrôle nous avons remarqué une amélioration du rendement par un facteur de 0,5 sur la concentration totale de lipides totaux extraits. Les concentrations de biomasse et de lipides réelles (expérimentales) ainsi obtenues sont de 26,56g/L de biomasse avec 10,12g/L de lipides dans les conditions de contrôle et de 27,6 g/L de biomasse et de 16.16g/L de lipides pour les études incluant la biotine. En outre, d’autres expériences réalisées sur la production de lipase et d’acide citrique chez Y. lipolytica ont été discutées. Le milieu de fermentation est composé de glycérol brut et de savon comme source de carbone. La production supplémentaire d'acide citrique peut être valorisée par son usage en nutrition et autres applications connexes. Dans le cas de la lipase, elle peut être extraite et utilisée dans l'industrie des détergents ou encore pour diluer le milieu de culture pour la fermentation lipidique. En recyclant le bouillon de fermentation contenant la lipase, il est possible de solubiliser les matières grasses et le savon à hautes concentrations dans le milieu de culture avant inoculation afin de faciliter la fermentation et l’homogénéisation du milieu de culture. Une approche métagénomique basée sur Illumina Miseqe a permis d'évaluer les boues secondaires issues d’industries de pâtes et papiers. L'analyse de la communauté microbienne a révélé l’occurrence de différents produits à valeur ajoutée à partir des microbes indigènes des boues en question. En outre, sur la base de l'UTO (Unités Taxonomiques Opérationnelles) l'abondance de chaque UTO a été calculée. La classification taxonomique UTO a illustré la présence de microbiome multifonctionnel dans les boues papetières. D'après la classification taxonomique et la base de données en littérature, de multiples applications possibles (lipides, des acides organiques, des biopolymères, des enzymes et des Exopolysaccharides) ont été évaluées.

Abstract

The mitigation of climatic change due to high carbon release from synthetic fuels, ever increasing demand and rapid depletion of petroleum fuel resources demands the search for alternative carbon neutral fuels. In this context, renewable oils from oleaginous microbes produced from renewable resources like glycerol, plant oils, agro residual waste, municipal solid and liquid waste, forest and other industrial waste harboring microbiologically utilizable carbon hold a promise for future energy demands. Currently, various renewable fuels mainly fuel ethanol is produced from molasses or other easily available fermentable sugars. In the meantime, lipid synthesis from microbe has a long tradition and several TAG (Triacylglycerides) of high economic importance were produced. These microbes possess a wide array of substrate utilization properties. Oil harboring microbes accumulate lipid varying from 20 to 85% (w/w) of total cell dry biomass. Taking advantage of these properties in the present study glycerol and other agro-industry wastes were evaluated for lipid production. Soil samples collected from virgin forest soils and glycerol contaminated soils were screened on crude glycerol supplemented selection media. Bacteria, yeast, and filamentous fungal strains appeared within 48h of incubation time were selected for further screening. All the isolates were grown in crude glycerol (CG) enriched nitrogen deficient media for 120h. Harvested cells were stained with Sudan black B and observed under phase contrast microscope. Organisms that possessed oil globules were selected for secondary screening. All the organisms were initially identified by Biolog followed by (18s rDNA) sequencing. In secondary screening a CG concentration of 100 g/L and two different C/N ratios were chosen and the fermentation was conducted up to120h. Based on the results obtained the strain SKY7 (lipid content 45% w/w) was chosen for further studies. SKY7 was identified as Yarrowia lipolytica by biolog and 18s rDNA sequencing method. This strain is a well-known for lipid and citric acid production and capable of utilizing a wide range of substrates. Further, the culture parameters were evaluated for Y. lipolytica SKY7 in order to achieve high lipid production. Initial shake flask experiments were carried out at different glycerol concentrations, C/N molar ratio, inoculum size, and trace element concentrations. The results showed a glycerol concentration of 100g/L with a C/N ratio of 100 is optimal for biomass and lipid production. Based on the results, fermentation was carried out (15L reactor with working volume of 11L) with 100g/L glycerol, C/N molar ratio 100 and 5% v/v inoculum without the addition of trace elements and with and without controlling the pH. The obtained results indicate that lipid synthesis was observed between 30 to 60h. In the case of pH controlled experiments, a lipid concentration of (43.2%w/w) 7.78g/L with a biomass concentration of 18g/L was achieved. Even though, the similar amount of biomass concentration was observed in fermentation under uncontrolled pH conditions lipid concentration was significantly low (15%) compared to pH controlled experiments. Hence, it is concluded that controlling pH will improve the lipid synthesis. Moreover from the experimental results, it was assumed that Y.lipolytica SKY7 required a C/N molar ratio between 350 to 400 when it enters into lipogenic phase. Maintaining the C/N molar ratio at the reported range extends the lipogenic phase and improves the overall lipid production. The above study demonstrates the potential of lipid production by Y.lipolytica SKY7 from crude glycerol-based synthetic media. In order to maximize the lipid and biomass concentration, a Box-Behnken method was employed and the principle parameters in lipid production (glycerol concentration, C/N molar ratio and inoculum volume) were investigated. The statistically optimized cultivation condition (glycerol concentration 82.5g/L and C/N ratio 75 with inoculum volume 6.25v/v) resulted in 29.5g/L biomass with 50%w/w lipid accumulation. To improve the lipid production from heterotrophic microbes, an alternative approach in terms of replacing the commercial nutrients sources was attempted. Based on the studies organic and inorganic nitrogen sources were replaced by silos leachate and the initial results showed a prospect of utilizing low-cost waste material as a nutrient source for lipid synthesis. This adds to the process in the following ways: 1) makes it economically feasible 2) environmental protection by nutrient removal from waste streams, thereby reducing the mitigation of local climate change and 3) value addition of waste stream. Further, the studies conducted in fermenter scale (15L) with the supplementation of silos leachate (200mL/L) resulted in a biomass and lipid concentrations of 25.82 and 15.15g/L, respectively within 51h of fermentation. The biomass and lipid yield thus obtained was 83.45g/C mole and 53.28g/C mole with a lipid content of 63.85%w/w on dry cell mass. However, replacing the nutrient source alone cannot make the process economically feasible. The operational conditions also influence greatly in the process economy. The sterilization of reactor and media components is a high energy demanding process. Thus, eliminating the sterilization step could boost the overall process economy. A methanol-based non-sterile process was investigated to eradicate the sterilization process. Initial results obtained from the shake flask experiments showed a biomass accumulation of 9.8g/L with a lipid content of 48% w/w with a supplementation of 3% methanol. However, when the similar conditions were replicated on controlled fermentation in fermenter the process failed (observed contamination) at 18h of the fermentation process. Hence, yet another alternative approach was formulated. A 10 minutes UV treatment was introduced to treat the tap water before it was added to dilute the media. Due to the UV treatment, an addition of 3%v/v methanol the occurrence of contamination was prolonged to 42h. This resulted in a high biomass (17.57g/L) and lipid (8.8g/L) accumulation in a non-sterile condition. When it was compared with the previous experimental condition (3%v/v methanol alone) the biomass and lipid concentrations were improved 3 and 4 times, respectively. In order to improve the lipid accumulation in cells, a biochemical approach was attempted. A series of biotin (10, 50 and 10μg/L) supplementation to the fermentation media was studied. In general biotin is one of the important growth factor, which is required for cell wall lipid synthesis. Moreover, biotin is known as the main prosthetic group (ACC- Acetyl CoA Carboxylase) in the carboxylation of Acetyl CoA to malonyl CoA in TAG synthesis. Earlier reports on biotin supplementation were reported to improve the long chain fatty acid production. In the present case, the addition of 100μg/L biotin was notably improved the lipid concentration in batch cultures of Y.lipolytica. Compared to the control conditions a half fold increase in lipid concentration was observed. The actual biomass and lipid concentration thus obtained was 26.56 g/L biomass with 10.12 g/L lipid in the case of control and 27.6 g/L biomass and 16.16 g/L lipid in the case of biotin supplemented studies. Furthermore, studies with Y.lipolytica results in citric acid and lipase production in the media with glycerol and soap as a carbon source. The additional production of citric acid can be extracted and used for food and other for applications. In the case of lipase, it can be extracted and used in detergent industry or it can be re-utilized to dilute the media. Using the fermentation broth containing lipase will help to solubilize the fat and soap prior to inoculation to aid the fermentation. A metagenomics approach based on Illumina MiSeq was attempted to evaluate the pulp and paper industry sludge. The microbial community analysis revealed the capacity of different value added products from the microbes originated in the sludge. Further, based on the OUT’s (operational taxonomic units) the abundance of each OUT was calculated. The taxonomic classification of OUT revealed the presence of multifunctional microbiome in pulp and paper sludge. Based on the taxonomic classification and the available literature the possible applications (lipid, organic acids, biopolymer, enzymes, and exopolysaccharides) were assessed.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar Dayal
Co-directeurs de mémoire/thèse: Valéro, José
Mots-clés libres: biotechnologie environnementale;
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 09 avr. 2019 21:12
Dernière modification: 09 avr. 2019 21:12
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/8025

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