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Étude de la régulation du complexe ligno-cellulotytique de Streptomyces lividans

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Bizouarn, Francisco (1996). Étude de la régulation du complexe ligno-cellulotytique de Streptomyces lividans Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 178 p.

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Résumé

Trois méthodes de mutagénèse ont été utilisées lors de ces travaux: la mutagénèse par élimination d'un site de restriction unique (SRU), la méthode de Kunkel (simple brin polyuracil) et la mutagénèse par amplification élective à l'aide de la polymérase (PCR). La méthode la plus puissante était cette dernière car elle permet de produire facilement des mutants. Cette méthode permet entre autre, l'examen de la progression de la mutagénèse à chaque étape.

Le gène codant pour la biosynthèse de la cellulase A de S. lividans 1326 a été muté afin de modifier le codon d'initation TTG en ATGet le codon suivant AAA en AAG. La mutation du codon de départ double la production de cellulase A comparée à celle du gène sauvage . Par contre, la mutation du codon AAA en AAG diminue la production de cellulase A à 500% de celle du sauvage. Le double mutant ATG-AAG donne une production de cellulase A approximativement équivalente à celle du clone sauvage.

Le gène de la cellulase B a dans sa séquence codant le peptide signal deux codons TT A dont r ARNt est codé par le gène bldA qui n'est exprimé que lors du métabolisme secondaire. La production de cellulase B par la souche sauvage est extrêmement faible due à cette régulation. Les clones dont l'un des codons TT A est remplacé par un CTG produisent la cellulase B dès le départ en quantités nettement supérieures à celle de la souche sauvage mais de façon encore relativement faible. Par ailleurs, le double mutant n'ayant plus la restriction imposée par l'ARNt produit huit fois plus de cellulase B que la souche sauvage. Le clonage des gènes mutés Tl (mutant pour le premier codon TTA), T2 (double mutant), T3 (mutant pour le deuxième codon TT A), du gène sauvage (WT) et du contrôle négatif (pSUR) dans la souche S. lividans 11725 (souche b/dA) donne un taux de sécrétion de cellulase B similaire à celui produit par S. lividans 1326.

Deux gènes hybrides ont été construits comportant la séquence du promoteur, du site de fixation des ribosomes et du peptide signal de x/nA et la séquence codant la protéine mature de la cellulase A ou de la cellulase B. Ces gènes hybrides ont été construits afin d'outrepasser les restrictions imposées par les codons du peptide signal des gènes celA et celB et pour profiter de la puissance du promoteur de xlnA. Dans la souche S. lividans 1326, le clone porteur du gène hybride x/nA-celA produit deux fois plus de cellulase A que le gène ce/A. Enfin, le clone avec le gène xlnA-ce/B produit au delà de 40 fois plus de cellulase B que le clone avec le gène sauvage celB.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Shareck, François
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 30 avr. 2018 00:24
Dernière modification: 30 avr. 2018 00:24
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/6679

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