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Validation de l’utilisation de différents systèmes CRISPR pour l’obtention de lignées DFF40 négative.

Séguin-Grignon, Marie-Noëlle; Johnson, Bruno; Malboeuf, Valérie; Bernier, Jacques (2016). Validation de l’utilisation de différents systèmes CRISPR pour l’obtention de lignées DFF40 négative. In: 12ème colloque du centre de recherche Biomed, 5 mai 2016, Centre de congrès Palace, Laval (Québec).

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Résumé

Le facteur de fragmentation de l’ADN, le DFF40, est une endonucléase nucléaire responsable de la fragmentation de l’ADN en 200pb lors de l’apoptose. Une modification de l’expression ou de l’activité du DFF40 est associée à un mauvais pronostique de certains cancers. Jusqu’à maintenant, les études qui ont démontré l’importance du DFF40 dans les traitements de chimiothérapie face au cancer ont été issues de preuve indirecte. En effet, des mutants de son inhibiteur/chaperon, le DFF45, ont été utilisés. Des lignées cancéreuses où l’inactivation du DFF40 et l’absence de fragmentation internucléosomale ont aussi démontré une moindre sensibilité aux drogues. Dans le but de développer des lignées n’exprimant pas le DFF40, nous avons utilisé deux technologies de CRISPR, soit de la compagnie Genecopoia TM et de la compagnie Origene . Les cellules HeLa et des cellules HepG2 ont été utilisées. Le premier système a pour avantage de pouvoir utiliser un seul plasmide, mais l’ajout du gène de résistance est temporaire. Les cellules HeLa ont donc été transfectées, puis mises en sélection pour une période de 7 jours. Par la suite, les cellules ont été isolées par dilution limite, puis par sélection de colonies. Pour le deuxième modèle, les cellules HepG2 ont été co - transfectées avec le plasmide CRISPR et un plasmide donneur permettant l’intégration de la séquence de résistance à l’antibiotique directement dans le génome. Les cellules ont été mises en sélection en continue. Des dilutions limites ont été effectuées afin d’obtenir des clones en parallèle à la sélection de colonies. Dans les deux cas, l’expression génique et protéique ont été respectivement étudiées par PCR et immunobuvardage de type western. Contrairement aux attentes, les clones de cellules HeLa n’exprimant plus la protéine semble exprimer encore l’ARNm, tandis que les clones HepG2 sans la protéine n’ont plus d’expression d’ARNm. Également, l’impact de l’absence de l’expression du DFF40 sur l’apoptose des cellules HeLa et HepG2 est étudié afin de valider le modèle. Nos résultats démontrent que les deux méthodes sont efficaces, mais que certaines approches sont plus appropriées pour certaines cellules.

Type de document: Document issu d'une conférence ou d'un atelier
Informations complémentaires: Présentation par affiche
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 24 déc. 2017 17:30
Dernière modification: 26 déc. 2017 16:53
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/5813

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