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Purification et caractérisation de la protéine codée par le gène bxl A de Streptomyces lividans

Lam, Thuy Diem Trinh (1999). Purification et caractérisation de la protéine codée par le gène bxl A de Streptomyces lividans Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 153 p.

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Résumé

Les streptomycètes sont des microorganismes retrouvés dans la nature et sont capables de dégrader la biomasse végétale afin d'en tirer leur source de carbone. Une des enzymes importantes pour la dégradation du xylane est la 13-xylosidase. En effet, cette enzyme catalyse la dernière réaction de l'hydrolyse des xylo-oligosaccharides en xylose. Pronovost (1991) avait isolé le gène bxlA codant pour une ~-xylosidase à partir du plasmide piAF2. Par la suite, d'autres études ont été entreprises sur ce plasmide mais les résultats n'étaient pas reproductibles quant à l'activité de la 13-xylosidase. Ceci était probablement dû à l'absence d'un promoteur naturel de streptomycètes en amont du gène bx/A. Larocque (1997) avait réalisé l'analyse génétique du plasmide et avait séquencé le gène bx/A. Il avait ensuite effectué un alignement de séquences en acides aminés de la protéine BxlA. Celle-ci appartient à la famille 3 des glycosyl hydrolases et montre de 1•homologie avec des 13-xylosidases et des 13-glucosidases retrouvées chez d'autres microorganismes. Afin de déterminer si le gène bx/A codait pour une 13-xylosidase, une 13-glucosidase ou pour une enzyme ayant les deux activités, il a fallu la purifier. Par conséquent, le but du projet était d·obtenir la protéine BxlA pure afin de la caractériser.

Plusieurs tentatives pour amplifier le gène bx/A de 2.6 kpb ont échoué. Par contre. il a été possible d'amplifier deux fragments du gène bx/A correspondant aux régions aminée et carboxylique de la protéine BxlA. Le gène a été ensuite reconstruit et cloné de façon homologue dans le vecteur d'expression à copie multiple, piJ702 afin de le surexprimer pour faciliter la purification de la protéine. Des techniques de chromatographie par FPLC et par filtration moléculaire ont permis d'obtenir une enzyme à un degré de pureté satisfaisant malgré son instabilité. Des gels de polyacrylamide en conditions dénaturantes ont été utilisés pour visualiser les échantillons de l'enzyme pure et ces derniers ont révélé une protéine de 90 kDa. Ces résultats confirment la masse moléculaire prédite par la séquence nucléotidique de BxlA. L'enzyme a été d'abord caractérisée au niveau de son pH et de sa température optimale. Ensuite. r affinité de BxiA pour différents substrats tels que le para-nitrophényi-P-D-xylopyranoside (pPNX) et le para-nitrophényl-P-D-glucopyranoside (pNPG) ainsi que pour les oligosaccharides dont le xylobiose (X2), le xylotriose (X3), le xylotétraose (X4), le xylopentaose (X5), le cellobiose (G2), le cellotriose (03), le cellotétraose (G4) et le cellopentaose (05) a été analysée. Des essais enzymatiques effectués avec le pNPX et le pNPO ont démontré que BxlA ne comportait qu'une activité P-xylosidasique. De plus, les expériences effectuées sur les substrats naturels sont en accord avec les résultats obtenus avec le pNPX et le pNPG : l'enzyme n'hydrolyse que les X2, X3, X4 et X5. Toutefois, BxiA agit plus efficacement sur les polysaccharides à faible degré de polymérisation tels que le X2 et le X3.

Type de document: Thèse Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Shareck, François
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 25 oct. 2017 15:15
Dernière modification: 25 oct. 2017 15:15
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/5772

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