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ÉTUDE DE L’INFLUENCE DE PRÉCURSEURS DE LA TESTOSTÉRONE SUR L’EXCRÉTION ET LA SIGNATURE ISOTOPIQUE DE SES MÉTABOLITES DE PHASE II

Trudel, Marc-André (2016). ÉTUDE DE L’INFLUENCE DE PRÉCURSEURS DE LA TESTOSTÉRONE SUR L’EXCRÉTION ET LA SIGNATURE ISOTOPIQUE DE SES MÉTABOLITES DE PHASE II Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 294 p.

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Résumé

La prise de stéroïdes androgènes anabolisants endogènes à des fins de dopage est une problématique qui est toujours d’actualité malgré les nombreux effets secondaires connus. Pendant plusieurs années, ces stéroïdes, tels que l’androstènedione, la déhydroépiandrostérone (DHEA), la testostérone et la prégnénolone, se retrouvaient facilement dans les suppléments alimentaires en vente libre. Pour détecter la prise de ces substances, les analyses antidopage mettent l’emphase sur la variation du profil stéroïdien des métabolites de phase II glucuroconjugués. Cependant, plusieurs métabolites sont excrétés comme sulfates, en particulier les stéroïdes possédant une fonction hydroxyle en position C-3β. Nous avons décidé d’analyser par CG-SM/SM ces métabolites de phase II excrétés suite à une prise ponctuelle de ces substances au cours d’étude d’excrétion avec plusieurs volontaires sains. Une différence dans la méthode d’extraction consiste à l’hydrolyse enzymatique des glucuronides comparativement à une hydrolyse chimique des sulfates, afin d’éviter des réactions secondaires indésirables.

Les sondes de détection traditionnelles consistent en une variation anormale du profil stéroïdien d’un individu dans le temps, nommé le Passeport biologique de l’athlète, ainsi qu’un rapport de concentrations de la testostérone sur l’épitestostérone (T/E). Les analyses ont permis de décrouvrir un autre rapport intéressant, celui de la 3α,17β-dihydroxy-5β-androstane sur l’épitestostérone (5β-adiol/E) de la fraction glucuronide. Celui-ci n’est pas spécifique à la prise d’un stéroïde particulier, mais permet la détection d’un profil anormal. L’utilisation d’androstènedione a mené à l’excrétion de métabolites spécifiques, soit la 2α-hydroxyandrost-4-ène-3,17-dione, la 6α-hydroxyandrost-4-ène-3,17-dione, la 3α,6β-dihydroxy-5α-androstan-17-one et la 3β,6β-dihydroxy-5α-androstan-17-one. Dans le cas d’une prise de DHEA, un rapport de concentrations de métabolites sulfoconjugués semble spécifique et permettrait la confirmation d’une utilisation, comme suggéré par le rapport de la 3β,7β-dihydroxyandrost-5-èn-17-one sur la 3α,16α-dihydroxy-5α-androstan-17-one (7βOH-DHEA/16αOH-A). Dans le cas d’une prise de prégnénolone, seules les concentrations excrétées de prégnandiol sont augmentées.

Afin de confirmer l’origine exogène ou endogène des stéroïdes suivant la détection d’un profil stéroïdien anormal, il est nécessaire d’évaluer leur signature isotopique du carbone, qui consiste en un rapport des isotopes 13C et 12C (δ13C) du métabolite comparé à celui d’un stéroïde de référence endogène, tel le prégnandiol. La méthode d’analyse par CG-C-SMRI est sensible et nécessite la purification des extraits urinaires pour éviter un fractionnement isotopique. Cette purification est effectuée au moyen d’une séparation par chromatographie liquide et est utilisée couramment pour les métabolites de la fraction glucuronide. Par contre, la présence de nouveaux métabolites dans la fraction sulfate en concentrations variables a empêché l’utilisation de la méthode de purification traditionnelle. Il a donc été nécessaire de développer une méthode de séparation par chromatographie liquide à deux dimensions afin de recueillir les différents métabolites en des fractions distinctes.

Les valeurs δ13C mesurées suivant la prise de stéroïdes montrent un appauvrissement, confirmant une origine exogène, pour la majorité des métabolites, en particulier pour ceux apparaissant à la suite dans la chaîne biosynthétique, tels que la 3Ϋ,17β-dihydroxy-5Ϋ-androstane, la 3Ϋ,17β-dihydroxy-5β-androstane, l’androstérone et l’étiocholanolone. Ceux-ci montrent des valeurs synthétiques pendant plusieurs dizaines d’heures, variant selon l’individu, en particulier pour les métabolites réduits en 5β, qui offrent un potentiel diagnostic plus intéressant que leurs isomères réduits en 5Ϋ. Dans le cas d’une prise de prégnénolone, le seul métabolite appauvri est la référence, le prégnandiol, confirmant l’aspect masquant de la prégnénolone. Il est alors nécessaire d’évaluer une deuxième référence, la 3Ϋ-hydroxy-5Ϋ-androst-16-ène, qui reste stable peu importe les stéroïdes androgènes anabolisants utilisés.

Les résultats montrent peu de différence entre les métabolites des fractions glucuronide et sulfate. Ces derniers pourraient être utiles dans certains cas à des fins de confirmation seulement, car leur analyse est laborieuse contrairement à leurs homologues glucuronides. En particulier au niveau des analyses CG-C-SMRI, les signatures isotopiques du carbone obtenues sont très similaires et ces résultats supplémentaires deviennent alors redondants.

Abstract

The intake of endogenous anabolic androgenic steroids for doping purposes is an issue that is still relevant despite the many known side effects. For many years, these steroids, such as androstenedione, dehydroepiandrosterone (DHEA), testosterone and pregnenolone, easily found themselves in over-the-counter food supplements. To detect these substances, anti-doping analysis put the emphasis on the variation of phase II glucuronide metabolites from the steroid profile. However, several metabolites are excreted as sulfate, in particular steroids having a hydroxyl function at C-3β. We decided to analyze by GC-MS/MS these phase II metabolites excreted after an intake of these substances during an excretion study with several healthy volunteers. A difference in the method of extraction consists in the enzymatic hydrolysis of glucuronides compared to chemical hydrolysis of sulfates, in order to avoid undesirable side reactions.

Traditional detection sensors consist of an abnormal variation of the steroid profile of an individual over time, named the athlete biological passport, and a concentration ratio of testosterone to epitestosterone (T/E). Our results show another interesting ratio, the 5β-androstane-3α,17β-diol on epitestosterone (5β-adiol/E) of the glucuronide fraction. That is not specific to the outlet of a particular steroid but allows the detection of an abnormal profile. The use of androstenedione led to the excretion of specific metabolites, the androst-4-ene-2α-ol-3,17-dione, androst-4-ene-6α-ol-3,17-dione, 5α-androstan-3α,6β-diol-17-one and 5α-androstan-3β,6β-diol-17-one. In the case of an intake of DHEA, a ratio of concentrations of sulfate metabolites appears to be specific and allows the confirmation of use, as suggested by the ratio of the androst-5-ene-3β,7β-diol-17-one on the 5α-androstan-3α,16α-diol-17-one (7βOH-DHEA/16αOH-A). In the case of an intake of pregnenolone, only concentrations of pregnanediol are increased.

To confirm the exogenous or endogenous origin of steroids following the detection of an abnormal steroid profile, it is necessary to assess their carbon isotope signature, which is a ratio of 13C and 12C isotopes (δ13C) compared to that of an endogenous reference steroid, such as pregnanediol. The method of analysis by GC-C-IRMS is sensitive and requires purification of urinary extracts to avoid isotopic fractionation. This purification is carried out with a separation by liquid chromatography and is commonly used for metabolites of the glucuronide fraction. However, the presence of new metabolites in the sulfate fraction in highly variable concentrations prevented the use of the traditional purification method. Therefore, it was necessary to develop a separation method using two-dimensional liquid chromatography, in order to collect the different metabolites in separate fractions.

The δ13C values measured after the intake of steroids show depletion, confirming an exogenous origin for the majority of metabolites, particularly those appearing afterwards in the biosynthetic chain, such as 5α-androstane-3α,17β-diol, 5β-androstane-3α,17β-diol, androsterone and etiocholanolone. These show synthetic values for several hours, which vary according to the individual, especially for metabolites reduced in 5β, a condition that offers an interesting diagnosis potential over their 5α reduced isomers. In the case of the intake of pregnenolone, the only depleted metabolite is the reference pregnanediol, confirming the masking potential of pregnenolone. Therefore, it is necessary to assess a second reference, the 5α-androst-16-ene-3α-ol, which remains stable regardless of any anabolic androgenic steroid used.

The results show little difference between metabolites from the glucuronide and sulfate fractions. The latter could be useful in certain cases for confirmatory purpose only, because their analysis is laborious unlike the glucuronides. Especially with the GC-C-IRMS analysis, the isotopic signatures obtained are very similar and these additional results then become redundant.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Ayotte, Christiane
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 16 juin 2017 19:14
Dernière modification: 16 juin 2017 19:14
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/5267

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