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Tropisme in vitro du parvovirus porcin

Hébert, Benoît (1999). Tropisme in vitro du parvovirus porcin Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 178 p.

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Résumé

Les virus de la famille des Parvoviridae sont caractérisés par leur génome d'ADN simple brin, généralement de polarité négative, encapsidé dans un assemblage protéique icosaédral d'environ 26nm de diamètre. Malgré leur petite taille et leur génome limité d'environ 5 kb, l'organisation génomique ainsi que la réplication des parvovirus sont néanmoins complexes. De plus, la majorité des membres de cette famille sont associés à plusieurs pathologies chez diverses espèces.

Chez le porc, les infections parvovirales causent des problèmes liés à la reproduction. Des travaux antérieurs ont démontré l'existence de plusieurs souches dont la virulence varie considérablement. Les présents travaux ont pour objectif de caractériser, au niveau moléculaire, les différences pouvant être responsables de cette virulence accrue chez certaines souches.

Par analogie avec d'autres parvovirus, notamment le parvovirus canin où la capside est responsable du spectre d'hôte félin-canin, notre hypothèse nous permettait d'entrevoir que la capside du penchant porcin joue probablement un rôle important dans le tropisme cellulaire du virus et finalement comme facteur modulant la virulence par l'interaction avec les cellules cibles. Ce tropisme pourrait déterminer le type de pathologie associé à l'infection.

Nos travaux ont tout d'abord été centrés sur le séquençage complet de la souche Kresse du parvovirus porcin et l'analyse de cette séquence. Nous avons démontré que la souche vaccinale NADL-2 et la souche pathogénique Kresse ne diffèrent que par 5 acides aminés dans le gène de la capside. Outre ces différences, le génome viral entier ne comporte que de différences non codantes. Une autre différence pour laquelle aucune fonction n'est encore connue est la présence d'une répétition de 127 nucléotides en aval de la région codante du gène de la capside chez la souche vaccinale. Cette séquence répétée n'est présente qu'en un exemplaire chez la souche Kresse tout comme chez les autres souches pathogéniques partiellement séquencées. De telles répétitions sont présentes chez d'autres parvovirus mais aucune fonction ne leur est encore associée.

Afin de comprendre l'importance de la capside dans le tropisme viral, étant donné que nos résultats suggèrent que celle-ci est la seule composante du virus ayant, a priori, un impact possible lors de l'infection, nous devions établir un système in vitro permettant de distinguer les souches non-pathogéniques des souches pathogéniques. Un criblage de plusieurs lignées cellulaires ne nous a pas permis de distinguer les souches NADL-2 et Kresse par un test d'infectivité. Par contre, nous avons identifié qu'une culture primaire de testicules de veaux (TV} utilisée pour la détection et l'amplification de virus appartenant à d'autres familles était également permissive au parvovirus porcin dans certains cas. Nous avons alors démontré que seulement les souches apparentées à la souche vaccinale NADL-2 pouvaient se répliquer sur ces cellules contrairement aux souches virulentes apparentées à la souche Kresse. Ayant établi pour la première fois un système in vitro permettant de déterminer le phénotype des souches de parvovirus porcin, nous devions maintenant déterminer si effectivement la capside était le facteur déterminant du tropisme observé.

Seule l'obtention des clones infectieux des souches NADL-2 et Kresse nous a permis de réaliser ces travaux. Nous avons procédé à 1'é change d'un fragment génomique (entre NADL- 2 et Kresse) codant pour trois des cinq résidus qui diffèrent entre NADL-2 et Kresse. Bien que ces virus ne soient pas différents en apparence lorsque cultivés sur des cellules permissives PT (testicules de porcs), la croissance des chimères sur les cultures primaires TV était apparentée non pas à la majeure partie du génome viral mais dépendait seulement du fragment échangé.

Ces résultats constituent la première preuve que le tropisme cellulaire du parvovirus porcin dépend, du moins in vitro, exclusivement de la capside. De plus, par analogie au parvovirus canin dont la structure tridimensionnelle est connue, deux des trois résidus échangés se retrouvent probablement dans des régions externes des boucles de surface de la capside.

Nous avons poursuivi l'étude de l'infection in vitro par immunofluorescence dans diverses lignées cellulaires en combinaison avec les différentes souches ou chimères utilisées pour les autres travaux. Nous avons étudié morphologiquement la distribution des particules virales lors des étapes précoces de l'infection. Nos résultats montrent que la distribution des particules tôt dans l'infection ne concorde pas toujours avec le phénotype de restriction attribué à ces cellules.

Étant donné que notre modèle in vitro permet de comprendre comment le tropisme viral peut être régulé, nous avons eu comme objectif de déterminer la structure tridimensionnelle du parvovirus porcin. Afin de déterminer la structure atomique par diffraction de rayons-X, la première étape consistait à mettre au point des méthodes de purification de virus à grande échelle. La partie suivante de cette thèse fait donc état des méthodes développées afin de produire et de purifier le parvovirus porcin pour la cristallographie.

Finalement, un dernier chapitre porte sur une nouvelle méthode de mutagénèse dirigée développée en réponse à des difficultés techniques rencontrées avec les clones infectieux. Nous désirions déterminer les paramètres structuraux requis pour le tropisme, c'est pourquoi nous devions effectuer la mutagénèse des différents résidus (seuls ou en combinaison) responsables du tropisme observé.

En résumé, les travaux présentés dans cet ouvrage font état des premiers résultats démontrant l'importance de la capside du parvovirus porcin dans le tropisme cellulaire ainsi que d'une étude préliminaire des mécanismes qui en sont responsables. De plus, les méthodes développées afin de permettre la purification à grande échelle sont également présentées.

Type de document: Thèse Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tijssen, Peter
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 25 oct. 2017 15:07
Dernière modification: 25 oct. 2017 15:07
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/4903

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