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Interactions virus-cellule lors de l'infection par le parvovirus porcin

Boisvert, Maude (2014). Interactions virus-cellule lors de l'infection par le parvovirus porcin Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 197 p.

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Résumé

Le parvovirus porcin a été identifié et associé à des problèmes de reproduction chez les porcs dans les années 1960. L'infection d'un animal adulte est généralement asymptomatique. Les problèmes surviennent lors de l'infection d'une femelle en gestation. Ce virus est capable de passer la barrière placentaire, d'infecter et tuer les foetus en formation. Heureusement, des vaccins ont été développés afin de prévenir les problèmes de reproduction. Cependant malgré le fait que ce virus soit connu depuis plus de 50 ans, peu d'études portant sur la biologie du virus ont été effectuées. Le projet de thèse décrit ici avait donc comme objectif principal de mieux comprendre les interactions entre le virus et les cellules lors de l'infection in vitro. Pour le premier objectif, nous avons identifié plusieurs composantes cellulaires importantes lors des étapes précoces de l'infection. Nous avons montré que le virus s'attache sur les acides sialiques sur les protéines de la surface cellulaire et peut entrer dans la cellule autant par endocytose dans des vésicules de clathrine que par macropinocytose. La macropinocytose est un mode d'entrée peu spécifique et qui est montré pour la première fois pour un parvovirus. Nous avons aussi montré que les agrégats de virus, formés naturellement lors de l'infection entrent dans la cellule préférentiellement par macropinocytose, tandis que les particules virales isolées (purifiées) préfèrent l'endocytose dans les vésicules de clathrine. Dans la cellule, le virus utilise la voie endosomale, où l'acidification et le passage dans les endosomes tardifs/lysosomes ont été montrés essentiels. Pour le transport intracellulaire, autant les microtubules que l'actine ont un rôle important pour le bon déroulement de l'infection. Finalement, nous avons montré que l'activité du protéasome est essentielle pour l'infection. Notre second objectif de recherche était d'identifier les régions des protéines structurales qui sont requises pour la reconnaissance et leur transport au noyau. Les signaux de localisation nucléaire (NLS) sont de courtes régions riches en acides aminés v basiques. Nous avons montré qu'il y a deux NLS actifs classiques dans la région unique de VP1. La protéine majoritaire de la capside, VP2, ne contient pas de NLS classique. Nous avons donc émis l'hypothèse que le motif reconnu (NLM) dépend de la structure finale de la protéine qui sera transportée au noyau sous forme de trimère. L'analyse de la structure tridimensionnelle du trimère a permis d'identifier trois NLM potentiels. Nous avons montré que la région importante pour le transport des trimères de VP2 au noyau comprend les acides aminés K272, K275, K487, K533, R535 et R576, tous situés à proximité suite à l'assemblage en trimère. Ce motif est plus complexe que le motif en feuillet-~ identifié chez le protoparvovirus MVM. Notre troisième objectif de recherche consistait à déterminer si l'expression de la protéine non structurale NS1 était différente pour deux souches de PPV (NADL-2 et Kresse) qui ont des taux de réplication différents lors de l'infection in vitro. Des travaux précédents dans le laboratoire ont montré que peu importe la souche, il y a production efficace d'ADN double brin, une étape précédant l'expression de NS1. Il a cependant été montré que la cinétique d'amplification du génome viral lors de l'infection avec la souche Kresse est plus lente que lors de l'infection avec la souche NADL-2. C'est ce qui nous a motivé à vérifier l'expression de NS1. Nous avons montré que l'expression de NS 1 est retardée et efficace seulement dans la moitié des cellules lors de l'infection par Kresse comparativement à NADL-2. L'expression de la protéine NS1 est donc sans contredit une étape importante de l'infection et elle diffère selon la souche virale. Finalement, ce projet de recherche a permis d'augmenter significativement nos connaissances sur la biologie de l'infection par le parvovirus porcin. Plusieurs autres aspects de l'infection seraient maintenant intéressants à étudier tels que les mécanismes de livraison du génome au noyau ou l'export des particules nouvellement formées à la fin de l'infection.

Abstract

Porcine parvovirus was identified and associated with reproductive problems in pig farms in the 1960's. Infection of the adult animal is usually asymptomatic, whereas infection during gestation can lead to infection and death of the fetus. An effective vaccine can prevent such reproductive problems in farrns, but needs to be administered regularly. Despite the tact that this virus was known for over 50 years, research concerning its biology is limited. The principal aim of this thesis was to better understand the interactions between the virus and the host cell in vitro. For the first objective, we identified several cellular components implicated in the early infection. We showed that the virus must first bind sialic acids on surface proteins. Then entry was possible bath by clathrin endocytosis and macropinocytosis. Macropinocytosis is a nonspecific entry mode, identified for the first time for a parvovirus in this project. We also showed that aggregates, naturally arising during infection enter cells preferentially by macropinocytosis, while single, purified particles preferred clathrin endocytosis. lnside the cell, the virus needs to go through the endosomal pathway and acidification and transit to the late endosomes or lysosomes is essential. Concerning intracellular transport, bath microtubules and the actin network were shawn to be important for the infection. Finally, we demonstrated that proteasome activity is essential for the infection. The second objective was to identify capsid protein sequences essential for their transport to the nucleus. Nuclear localization signais (NLS) are short stretches of basic amino acids. We showed that there are two classic NLS in the unique region of VP1 capsid protein. The major capsid protein, VP2, does not contain potential classic NLS. We hypothesized that the localization motif (NLM) was dependant on protein folding and assembly into trimers. Structural analysis of the trimer revealed three potential NLM. We showed that the active NLM for VP2 included amino acids K272, K275, K487, K533, vii R535 and R576, ali located in close proximity in the trimer. This NLM is more complicated than the one identified for the closely-related protoparvovirus MVM. The third objective was to evaluate whether the expression of the non-structural protein NS1 was different for two PPV strains (NADL-2 and Kresse) that do not replicate at the same rate in cell culture. Previous work in the lab showed that infection with both strains led to a good production of double stranded DNA, a step preceding NS 1 expression. However, infection with Kresse led to a delayed DNA amplification. We were then interested to look at NS1 expression after infection with these two strains. We showed th at NS 1 expression was delayed and effective in only half of the Kresseinfected cells compared to NADL-2 infection. NS1 expression is thus a crucial replication step, and different strains succeed differently at that step. Finally, this research project significantly increased our knowledge concerning porcine parvovirus infection. Other steps of the infection remain to be investigated such as the mechanisms of genome delivery to the nucleus and the export of complete capsid at the end of the infection.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Tijssen, Peter
Mots-clés libres: -
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 07 mars 2016 20:28
Dernière modification: 07 mars 2016 20:28
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/3332

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