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Rôle d’UL24 dans la formation de nouveaux génomes viraux lors de la réplication du virus herpès simplex 1

Boury, Faye (2015). Rôle d’UL24 dans la formation de nouveaux génomes viraux lors de la réplication du virus herpès simplex 1 Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 51 p.

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Résumé

Le virus herpès simplex 1 (VHS-1) est un agent pathogène qui infecte l‟Homme en ciblant les cellules épithéliales des muqueuses menant à la formation de lésions vésiculaires. Par la suite, il infecte les neurones sensitifs où il établit la latence. Le génome du VHS-1 est constitué d‟une molécule d‟ADN double brin linéaire divisée en deux segments : la région unique longue et la région unique courte. L‟existence de séquences répétées inversées de part et d‟autre de ces segments, permet l‟inversion de ces régions uniques par un mécanisme de recombinaison homologue. Ces évènements d‟inversion conduisent à la formation de quatre isomères présents en quantités équimolaires lors de la réplication du VHS-1. Au cours de cette étape, des intermédiaires de réplication vont se former et auront la particularité de présenter des structures très ramifiées. La résolution de ces ramifications est alors facilitée par l‟action de protéines à fonction nucléase. En effet, cette réplication virale se déroule selon un mode de cercles roulant qui vont produire de longs concatémères correspondant à plusieurs unités génomiques liées les unes aux autres. Un clivage spécifique de ces concatémères va permettre de libérer une unité génomique virale qui pourra ensuite être encapsidée pour former un nouveau virion. Le gène ul24 est très bien conservé à travers la famille des Herpesviridae et code pour une protéine à cinétique tardive. D‟autre part, il a été identifié un motif putatif d'endonucléase de type PD-(D/E)XK spécifique des membres de la superfamille des phosphodiestérases dans la partie N-terminale d‟UL24. Par ailleurs, la littérature rapporte que cette superfamille renferme des recombinases (Kosinski et al., 2005). Ainsi, il est proposé qu'UL24 favoriserait la production de nouveaux génomes viraux par un processus de recombinaison homologue lors de la réplication du VHS-1. Afin de tester l‟hypothèse qu‟UL24 intervient dans la formation de monomères génomiques, des cellules Vero ont été infectées par les souches virales KOS (souche sauvage VHS-1), UL24X (déficiente en UL24) et UL24XRescue (virus reconstitué). Des résultats préliminaires de notre laboratoire ont montré qu'UL24 favorise la production de monomères d'ADN génomiques du VHS-1. Nous voulions déterminer si le motif d'endonucléase était important pour la production de monomères du génome viral en vi profitant du mutant vUL24-E99A/K101A. Etant donné que ce mutant possède une mutation de substitution au niveau du site catalytique d‟un motif prédit d‟endonucléase, la disposition d‟un « Rescue » de ce mutant semble requise afin d‟étudier si ce dernier pourrait permettre de rétablir ce phénotype et ainsi déterminer si ce motif spécifique joue un rôle déterminant dans cette production génomique virale. Une stratégie basée sur la réaction de polymérisation en chaîne a été développée pour le criblage du virus « Rescue ». Ainsi, des approches de recombinaison homologue ont été menées afin de produire un virus « Rescue » à partir du mutant E99A/K101A. Un clone vUL24X-E99A/K101ARescue a été purifié puis caractérisé. Ce virus a ensuite été utilisé pour infecter des cellules Vero, ce qui a permis de démontrer un rétablissement dans la quantité de monomères génomiques à des niveaux comparables à ceux de KOS. Par la suite, un test de recombinaison a été effectué à partir de cellules infectées par KOS, UL24X et UL24XRescue. Ce test fait appel à l‟usage d‟une enzyme SpeI spécifique pour cliver une seule fois chaque unité d‟ADN génomique de concatémères viraux. Il en résulte la formation de fragments de 118, 152 et 186 kilobases présents à des ratios de 1:2:1 respectivement. Des résultats préliminaires ont permis d‟observer une réduction dans la quantité d‟un des isomères génomiques pour les cellules infectées par UL24X en comparaison à celles infectées par KOS ou UL24XRescue. En conclusion, ces résultats mettent en évidence un rôle du motif prédit d‟endonucléase d‟UL24 dans les mécanismes de synthèse de nouveaux génomes viraux, et suggèrent également un rôle de recombinase d‟UL24 lors de la réplication du VHS-1.

Abstract

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is a pathogenic agent that infects humans by targeting epithelial cells of the mucous membranes leading to the formation of vesicular lesions. Thereafter, it infects sensory neurons where it establishes latency. The genome of HSV-1 consists of a linear double stranded DNA molecule divided into two segments: a unique long region and a unique short region. The existence of inverted repeated sequences on both sides of these segments, allows the inversion of these unique regions by a mechanism of homologous recombination. These inversion events lead to the formation of four isomers present in equimolar amounts during the replication of the virus. During this stage, replication intermediates are formed which are characterized by highly branched structures. The resolution of these branches is then facilitated by the action of proteins possessing a nuclease activity. HSV-1 DNA replication is thought to occur via a rolling circle model which produces long concatemers corresponding to several genomic units linked as head-to-tail repeats. A specific cleavage of these concatemers releases a single viral genomic unit which can then be encapsidated to form a new virion. The ul24 gene is very well conserved throughout the Herpesviridae family and codes for a late protein. In addition, it has been shown to contain a PD (D/E) XK endonuclease motif, which is specific to the members of a phosphodiesterase superfamily. This motif is located in the N-terminal part of UL24. Interestingly, the literature reports that this superfamily contains recombinases (Kosinski and Al, 2005). Thus, we proposed that UL24 promotes the production of new viral genomes by a process of homologous recombination during HSV-1 replication. In order to test the hypothesis that UL24 is involved in the formation of genomic monomers, Vero cells were infected with the viral strains KOS (wild type strain of HSV-1), UL24X (defective in UL24) and vUL24XRescue (reconstituted virus). Preliminary results from our laboratory suggested that UL24 supports the production of genomic monomers of HSV-1 DNA. We set out to determine whether the endonuclease motif of UL24 was important for the production of viral genomic monomers by using the vUL24-E99A/K101A viral mutant. Since this mutant contains substitutions the putative catalytic viii site of the predicted endonuclease motif, the availability of a “Rescue” of this mutant was necessary to test if this specific motif plays a role in the production of viral genomes. A strategy based on a polymerization chain reaction was developed to screen for the “Rescue” virus. A homologous recombination approach was used to produce a “Rescue” virus from the vE99A/K101A mutant. A purified vUL24X-E99A/K101ARescue clone was purified and characterized. It was then used to infect Vero cells, which showed that vUL24X-E99A/K101ARescue can restore the quantity of genomic monomers to levels comparable with those of KOS. Thereafter, a recombination test was performed using cells infected with KOS, UL24X and vUL24XRescue. This test uses the SpeI restriction enzyme, which specifically cleaves each genomic DNA unit once. Cleavage of the viral DNA concatemers results in the formation of 118, 152 and 186 kilobase fragments present at ratios of 1:2:1 respectively. Preliminary results showed a reduction in the quantity of one of the genomic isomers for the cells infected by UL24X in comparison with those infected by KOS or vUL24XRescue. In conclusion, these results highlight a role for the UL24 endonuclease motif in the mechanisms of synthesis of new viral genomes, and also suggest a possible recombinase role for UL24 during the replication of the HSV-1.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Pearson, Angela
Mots-clés libres: vhs-1
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 07 mars 2016 20:33
Dernière modification: 07 mars 2016 20:55
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/3292

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