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Exploration of functional nuclear urotensin II receptors : biochemical and pharmacological characteristics, and specific tissue distribution

Nguyen, Thi Tuyet Mai (2013). Exploration of functional nuclear urotensin II receptors : biochemical and pharmacological characteristics, and specific tissue distribution Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 161 p.

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Résumé

L'urotensine Il (UII) a été initialement isolée de l'urophyse de gobie et il a été rapidement établi que le peptide possède plusieurs caractéristiques structurales similaires à celles de la somatostatine (SRIF). Ce peptide et son paralogue, l'urotensin II-related peptide (VRP), provoquent une vasoconstriction chez de nombreuses espèces y compris les poissons, les amphibiens et les mammifères. L'UII et l'URP sont les ligands endogènes du récepteur à 7 domaines transmembranaires nommé UT. En plus de leurs capacités à causer la contraction et la dilatation de tissus vasculaires, I'UII peut induire la prolifération de plusieurs types cellulaires ou encore causer par exemple l'hypertrophie des cardiomyocytes. En fait, le système urotensinergique est associé à de nombreuses pathologies humaines, et plus particulièrement aux maladies cardiovasculaires et rénales. Par contre, malgré la présence marquée du système urotensinergique dans le système nerveux central (SNC), une relation claire entre ce système et des pathologies du SNC n'a pas encore été établie, même si une injection intracérébroventriculaire (icv) d'UII provoque des effets centraux. L'UT appartient à la classe A de la super famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), une famille de récepteurs ayant comme archétype la rhodopsine. De façon générale, il est admis que ces récepteurs sont localisés à la membrane plasmique mais récemment, une localisation nucléaire a été démontrée pour de nombreux RCPGs. Notamment, les récepteurs de l'angiotensine II (Ang-11) et de l'endothéline 1 (ET-1) qui se retrouvent dans la même famille de récepteurs qu'UT et qui partagent des fonctions similaires, ont été observés au niveau des noyaux. Ces récepteurs nucléaires représentent donc de nouvelles cibles pharmacologiques et une bonne compréhension de leur activité cellulaire est essentielle pour le développement d'outils pharmacologiques adéquats. Ce projet d'étude visait donc à démontrer la présence de récepteurs UT fonctionnels au niveau du noyau de cellules isolées de divers organes. Nos résultats d'immunobuvardage de type Western ont permis d'établir pour la première fois la présence de ce récepteur aux noyaux de cellules dans les tissus du coeur et du système nerveux central chez le rat et le singe, et aussi dans des lignées cellulaires humaines de neuroblastomes et d'astrocytes. Étonnamment, parmi tous les ix tissus évalués, incluant le coeur, le cerveau, la moelle épinière, les reins, les glandes surrénales, le foie, les poumons, le pancréas et les muscles squelettiques qui expriment tous UT au niveau membranaire, la présence de ce récepteur au noyau n'a été observée que dans le coeur et le système nerveux central. De plus, cette régiosélectivité d'expression du récepteur UT aux noyaux des cellules ne semblent pas être une caractéristique propre à une espèce puisque ce phénomène a été observé chez le rat et le singe. Enfin, ces résultats ont été confirmés par immunofluorescence par microscopie confocale avec des coupes de coeur et de cerveau de ces deux espèces animales ainsi qu'avec des lignées cellulaires humaines. Un examen plus détaillé de l'expression de 1 'UT dans le SNC de rat a révélé que ce récepteur était exprimé dans tous les tissus centraux étudiés, i.e. le cortex, l'hypothalamus, l'hippocampe, le cervelet, le pons et la moelle épinière, tant au niveau des protéines totales que nucléaires. Par la suite, des études de liaison sur des noyaux isolés de coeur et de cerveau de rat ont permis de caractériser pharmacologiquement ce récepteur nucléaire. Pour ce faire, les deux ligands endogènes de l'UT, soit l'UII et l'URP, ainsi que l'urantide, un antagoniste de l'UT, et la somatostatine ont été utilisés. Les résultats ont démontré que les ligands de l'UT, soit l'UII, l'URP et l'urantide, étaient capables de déplacer l'UII radiomarqué lié aux sites de liaison situés sur des noyaux isolés alors que la somatostatine n'avait pas cette capacité. L'immunobuvardage 2D a dévoilé trois isoformes de 1 'UT dans les fractions membranaires et nucléaires de coeur ayant un même poids moléculaire mais des points isoélectriques différents, alors que dans les extraits provenant du cerveau, il semble que des modifications post-traductionnelles distinctes pour les récepteurs aux noyaux et à la membrane génèrent des espèces protéiques de poids moléculaires différents. Des essais d'initiation de la transcription utilisant de l'UII humaine et de rat, de l'URP et de l'urantide sur des noyaux isolés de coeur et de cerveau de rat ont démontré que ces récepteurs nucléaires étaient fonctionnels. Toutefois, les agonistes de l'UT ont modulé différemment la transcription car seule l'UII a été capable d'initier la synthèse de novo d'ARN. La question s'est ensuite posée à savoir si les deux peptides pouvaient atteindre leur récepteur nucléaire. Pour ce faire, des dérivés fluorescents des deux ligands endogènes ont été préparés pour évaluer leur capacité de pénétration cellulaire. Les résultats obtenus en microscopie confocale et par cytométrie en flux démontrent que les deux ligands de l'UT peuvent atteindre l'espace intracellulaire, l'UII pénètrant dans la cellule plus rapidement que l'URP, sans impliquer UT. En outre, le mécanisme x d'entrée de l'URP impliquerait principalement les cavéoles alors que l'UII n'utiliserait ce mécanisme que très partiellement. Comme mentionné ci-dessus, le système urotensinergique est associé à divers états pathologiques, mais une relation claire avec des atteintes centrales n'a pas encore été démontrée. Par ailleurs, dans cette étude, la présence d'UT a été clairement démontrée dans tous les tissus du SNC, tant dans les extraits totaux que nucléaires. Or, ces tissus sont très sensibles aux conditions hypoxiques et/ou ischémiques. Ainsi, l'influence de telles conditions sur l'expression de ce récepteur a été étudiée sur une lignée cellulaire humaine neuroblastomale en présence ou non d'un traitement avec l'UII ou l'URP. Nos résultats indiquent qu'une exposition au chlorure de cobalt (pour induire des conditions hypoxiques in vitro) diminue l'expression de l'UT nucléaire tandis que son expression totale augmente. De plus, un traitement avec l'un ou l'autre des deux agonistes de l'UT a ramené l'expression de l'UT à un niveau basal. Clairement, la localisation intracellulaire de ce récepteur est modulée en conditions hypoxiques et l'UII et l'URP pourraient avoir un effet répresseur sur cette modulation. Contrairement aux connaissances restreintes associées au SNC, le système urotensinergique a été largement étudié en relation avec les maladies cardiovasculaires. Au cours de cette étude, une analyse d'expression génique par micro-réseaux sur des noyaux isolés de cardiomyocytes de rat traités avec l'UII a permis d'élargir ces connaissances en suggérant que le récepteur nucléaire UT serait un médiateur de l'expression de certains gènes liés aux maladies cardiaques, au diabète ainsi qu'à la prolifération cellulaire. Globalement, notre étude suggère que les récepteurs UT fonctionnels présents au noyau joueraient un rôle physiologique complémentaire à l'activation des récepteurs UT à la membrane plasmique. Ces résultats offrent une nouvelle vision plus complexe du fonctionnement du système urotensinergique et pourraient ouvrir de nouvelles voies pharmacologiques dans le développement de stratégies pour le traitement de maladies cardiovasculaires.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Fournier, Alain
Mots-clés libres: urotensine II ; proteine g ; recepteur
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 06 nov. 2015 16:49
Dernière modification: 06 nov. 2015 16:49
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2781

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