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Investigating the structure-function-flexibility relationship of chitin- and xylan-degrading enzymes

Nguyen-Thi, Nhung (2014). Investigating the structure-function-flexibility relationship of chitin- and xylan-degrading enzymes Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 176 p.

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Résumé

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La dégradation enzymatique de la biomasse est un procédé biotechnologique de pointe visant la production de petites molécules hautement pertinente en synthèse organique. Ce processus a été largement étudié en raison de ses avantages en chimie verte, en plus de son application potentielle dans de nombreux domaines de la vie. Malgré l‘accumulation des connaissances au niveau des principes qui régissent la dégradation enzymatique de la biomasse, les objectifs fondamentaux et industriels de cette technologie demeurent encore sommaires. La découverte d‘enzymes efficaces et adaptées aux domaines biotechnologiques demeure un défi majeur en raison des problèmes de pureté des produits synthétisés, des faibles rendements de production enzymatique et du coût élevé des processus industriels provenant de la complexité de la biomasse de départ. Conséquemment, nous visons principalement à découvrir et à caractériser des glycoside hydrolases hautement actives et adaptées à de nombreuses applications industrielles. Une β-N-acétylhexosaminidase (ScHEX) et une chitinase (ChiC) de Streptomyces coelicolor A3(2) possédant des activités élevées envers les chitooligomères et les chitines cristallines ont été exprimées et caractérisées avec succès. En collaboration avec un groupe de l'Université York (York, Royaume-Uni), les structures cristallines de ScHEX native et du mutant ScHEX-E314Q ont été résolues afin de comprendre le mécanisme catalytique d'hydrolyse des chitooligosaccharides. En utilisant un mélange de divers surnageants composés de ScHEX et ChiC dans un essai en présence de chitine cristalline comme substrat, le produit final GlcNAc a été obtenu avec une pureté de 95% après 8 heures d'incubation, promettant un moyen efficace pour la production industrielle de GlcNAc pur. La flexibilité atomique chez les enzymes se révèle d'une importance cruciale dans la conversion enzymatique de polysaccharides. Il a été démontré que les mouvements moléculaires de protéines à différentes échelles de temps peuvent être impliqués dans la régulation de l'activité enzymatique, en jouant notamment un rôle essentiel dans le contrôle de la relation entre la structure et la fonction chez plusieurs systèmes enzymatiques. Pour étudier la dynamique interne et dans le but de déterminer si cette dynamique doit être considérée dans le génie enzymatique des glycoside hydrolases, des expériences de RMN ont été réalisées avec XlnB2 et XlnB2-E87A de Streptomyces lividans 66 en l'absence et en présence de ligands (xylobiose et xylopentaose). Les résultats de cristallographie révèlent que XlnB2 possède une structure conservée appelée "β-jelly-roll", ressemblant à l'architecture de la main droite. Nos données RMN montrent que, sous forme libre, les mouvements à l'échelle de temps de la catalyse enzymatique sont principalement regroupés sur la face de la cavité catalytique. Lors de la liaison aux ligands, l‘échange conformationnel émerge sur les deux faces de la cavité catalytique et dans le motif de la boucle "thumb loop", ce qui suggère un mouvement global de fermeture. D'autres résultats indiquent que l'implication des résidus de la boucle et de la cavité catalytique demeurent similaires suite à la liaison avec de courtes et longues chaînes de glucides. Ces résultats fournissent une preuve expérimentale directe validant le mécanisme d‘ouverture et de fermeture précédemment prédit par des structures cristallines et des simulations de dynamique moléculaire effectuées sur des xylanases homologues. En bref, cette étude permet de mieux comprendre la dynamique à l'échelle atomique de XlnB2, démontrant une relation directe entre la fonction et la dynamique de l'enzyme. Les résultats recueillis dans cette thèse permettent de mieux comprendre comment les glycoside hydrolases dégradent la biomasse. D'autres études seront nécessaires pour maximiser leur activité enzymatique et leur efficacité catalytique, ainsi que pour obtenir des informations supplémentaires visant l‘amélioration par ingénierie enzymatique de biocatalyseurs efficaces dans de multiples applications industrielles.

Abstract

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The enzymatic degradation of biomass is an advanced biotechnological method for the production of small molecules of organic synthesis relevance. This process has been extensively studied because of its benefits in green chemistry and its potential application in many fields of life. Although much knowledge about the principles that govern the enzymatic breakdown of biomass has been gathered, fundamental and industrial goals remain unachieved. Finding efficient enzymes adapted to applied biotechnology disciplines remains a challenge due to product purity issues, yields of enzymatic production, and high costs of degrading processes due to biomass recalcitrance. As a result, we are interested in finding and characterizing highly active glycoside hydrolases aimed at numerous industrial applications. A β-N-acetylhexosaminidase (ScHEX) and a chitinase (ChiC) from Streptomyces coelicolor A3(2) with high activity toward chitooligomers and crystalline chitins were successfully expressed and characterized. In collaboration with a group at the University of York (York, UK), crystal structures of the native ScHEX and of the mutant ScHEX-E314Q have been resolved in order to understand the catalytic mechanism of chitooligosaccharide hydrolysis. Using a mixture of supernatants from ScHEX and ChiC in an assay with crystalline chitin as substrate, GlcNAc was produced as a final product with yield of 90% after 8h of incubation, promising efficient applicability for the industrial production of pure GlcNAc. Enzyme flexibility was found to play an important role in enzymatic conversion of polysaccharides. It has been shown that internal protein motions on various timescales can be involved in regulating enzyme activity, playing a critical role in controlling the relationship between structure and function in several enzyme systems. To study internal dynamics and to investigate whether they should be considered in glycoside hydrolase engineering, NMR experiments were carried out with XlnB2 and XlnB2-E87A from Streptomyces lividans 66 in the absence and presence of ligands (xylobiose and xylopentaose). Crystallographic results reveal that XlnB2 conserves a β-jelly-roll scaffold, with a right-hand architecture. Our NMR data show that in the free XlnB2 form, catalytic time-scale motions primarily cluster on one face of the catalytic cleft. Upon ligand binding, conformational exchange emerges on both faces of the catalytic cleft and in the thumb-loop motif, suggesting a global clamping movement. Other results indicate very similar involvement of residues located on the thumb loop and active-site cleft upon binding with short- and long-chain carbohydrates. These results provide direct experimental evidence to validate the previously postulated open-closed mechanism predicted by crystal structures and molecular dynamics simulations performed on xylanase homologues. In short, this study provides further insight into the atomic-scale dynamics of XlnB2, indicating a relationship between function and the dynamics of the enzyme. The results collected in this thesis provide a better understanding of the glycoside hydrolase enzymes in biomass degradation. Further studies are required to optimize their enzymatic activity and catalytic efficiency, as well as to gain additional information for the proper engineering of improved biocatalysts used in several industrial applications.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Doucet, Nicolas
Mots-clés libres: chitine ; xylanase ; polysaccharide ; glucoside ; hydrolase ; chitinase ; streptomyces
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 05 nov. 2015 22:02
Dernière modification: 05 nov. 2015 22:02
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2762

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