Dépôt numérique
RECHERCHER

Contribution de la cellule hôte lors du mouvement intercellulaire du virus de la mosaique du navet.

Agbeci, Maxime (2013). Contribution de la cellule hôte lors du mouvement intercellulaire du virus de la mosaique du navet. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 100 p.

[img]
Prévisualisation
PDF
Télécharger (45MB) | Prévisualisation

Résumé

Le mouvement intercellulaire viral est une étape cruciale pour l'infection d'un hôte par un phytovirus. En ce qui concerne les phytovirus, ceux-ci quittent leur foyer d'infection en se déplaçant des cellules initialement infectées vers les cellules voisines. Les virus vont par la suite atteindre le système vasculaire de la plante et établir l'infection systémique de cette dernière. Pour pouvoir se déplacer de cellule en cellule, les phytovirus codent pour des protéines de mouvement (MP). Cependant, l'action de ces dernières ne peut se faire sans la participation de certains facteurs de la cellule hôte. En agissant de concert avec les MP, ces facteurs de la cellule hôte permettent le passage du complexe ribonucléoprotéique viral à travers les plasmodesmes (PDs). Parmi ces facteurs qui composent la machinerie de transport cellulaire et qui sont impliqués dans le mouvement intercellulaire viral, nous pouvons citer le cytosquelette, les myosines, et le système sécrétoire. Contrairement à la grande majorité des phytovirus connus à ce jour, les potyvirus n'ont pas de protéine dont le seul rôle est d'assurer le mouvement intercellulaire de l'entité virale. Aussi de précédentes études portant sur le mouvement intercellulaire viral ont montré que les voies de transport empruntées par les virus pour se déplacer de cellule en cellule ne sont pas toujours les mêmes, et peuvent être différentes d'un virus à un autre. De plus, les méthodes utilisées dans ces études ne permettent pas de toujours faire une distinction sans équivoque entre le mouvement intercellulaire viral et la réduction de la réplication de I'ARN viral. Dans cette étude, en étant capable de faire la différence entre les premières cellules infectées et celles résultantes du mouvement intercellulaire viral, nous avons conçu un nouvel outil qui nous a permis d'étudier la contribution du mécanisme de transport de la cellule hôte lors du mouvement intercellulaire du virus de la mosaïque du navet (TuMV). Afin de pouvoir différencier les foyers d'infection primaires des foyers d'infection secondaires qui eux sont dû au mouvement intercellulaire viral, nous avons inséré dans un vecteur binaire pCambia à la fois la séquence codante pour le clone infectieux du TuMV couplé à la protéine fluorescente mCherry et le gène codant pour une protéine GFP ciblée au réticulum endoplasmique (ER). Les deux gènes étant livrés dans la même cellule, les premières cellules infectées suite à l'agroinfiltration exprimaient les deux fluorochromes. Les foyers d'infection primaire étaient verts et rouges. Quatre à six jours suivant l'agroinfiltration, en plus de ces cellules vertes et rouges, on pouvait observer des cellules exprimant le fluorochrome rouge seulement, signifiant que le virus se déplaçait de cellule en cellule. Pour déterminer l'implication des voies de sécrétion précoces et tardives, de l'endocytose et du cytosquelette lors du mouvement intercellulaire du TuMV, nous avons utilisé des inhibiteurs chimiques et protéiques qui affectent différentes étapes de la machinerie de transport cellulaire. Le traitement par la Brefeldin A ou la Concanamycin A et l'expression de mutants dominants négatifs des protéines ARF1 ou RAB-E1d ont réduit de manière drastique le mouvement intercellulaire viral sans pour autant affecter sa réplication dans les foyers d'infection primaire. Un test d'interférence pharmacologique utilisant la Tyrphostin A23 et la Wortmannin a montré que l'inhibition de l'endocytose n'avait aucun effet sur le mouvement intercellulaire du TuMV. De plus, le manque de colocalisation entre FM4-64, Ara? (AtRabF2b) et le complexe de réplication virale induit par la protéine 6K2 ont confirmé que l'endocytose n'était pas impliquée dans ce processus. Contrairement aux microtubules, la dépolymérisation des microfilaments a aussi eu un effet drastique sur le mouvement intercellulaire du TuMV et un fait intéressant à noter est que l'usage de l'interférence ARN induite par un virus a montré que ce mouvement qui dépend des microfilaments était soutenu par l'action de la myosine Xl-2, mais pas par les myosines Vllls et XI-F. Nous proposons alors que lors du mouvement intercellulaire du TuMV, le complexe viral passe par des étapes de maturation progressive tout au long de la voie de sécrétion où le trafic post­ Golgi, le réseau d'actine et de myosines sont importants pour qu'il puisse rejoindre les PDs et passer d'une cellule à une autre.

Abstract

Plant viruses move from the initially infected cell to neighbouring cells during local movement and then over long distances through vascular tissues to establish a systemic infection of the plant. Transport between cells involves moving a viral RNA-protein complex through plasmodesmata (PDs) that requires among ethers viral movement proteins (MP). Although viral MP are at the core of virus intra-and intercellular movement, it is clear that host factors that are components of the host cell transport machinery, in particular the cytoskeleton, myosin motors and the secretory pathway are required. Potyviruses have no dedicated MP, which contrasts with the ether viruses that have been investigated for intercellular movement. Past studies on sustained intercellular movement of sorne viruses have shown that viruses may use different trafficking pathways to move from one cell to another. Also in those studies, the assays that have been used to investigate virus intercellular movement cannet always differentiate between reduced viral RNA replication and intercellular movement. ln this study by using a dual gene cassette construct encoding fluorescent proteins that can differentiate between primary infected cells from cells infected after intercellular transport we have designed a new tool to investigate the contribution of the transport machinery of the host cell in the intercellular movement of Turnip mosaic virus (TuMV). ln order to discriminate between agroinfiltrated primary infected cells from secondary infected cells and thus to assay viral intercellular movement, a gene cassette expressing GFP-HDEL was inserted adjacent to a TuMV infectious cassette expressing 6K2-mCherry both within the T-DNA borders of the binary vector pCambia. Since both gene cassettes were delivered into the same cell, primary infection foci were emitting both green and red fluorescence. Between day 4 and 6 after agroinfiltration, in addition to cells emitting both red and green fluorescence, cells emitting red fluorescence only were readily observed as a result of TuMV spreading from one cell to another. To determinate if either the early secretory pathway, late secretory pathway, endocytosis or the cytoskeleton were important for TuMV intercellular movement, chemical and protein inhibitors that affect different stages of the host cell transport machinery were used. Treatment with Brefeldin A or Concanamycin A and expression of ARF1 or RAB-E1d dominant negative mutants drastically reduced cell-to-cell movement of the virus but did not hamper virus replication in primary infected cells. A pharmacological interference assay using Tyrphostin A23 and Wortmannin showed that endocytosis in TuMV intercellular movement was not important. Lack of co-localization with the FM4-64 and Ara? (AtRabF2b) and TuMV-induced 6K2-tagged vesicles further indicated that these endocytic pathways are not important for TuMV local cellular spread. Microfilament, but not microtubule, depolymerising drugs also blocked intercellular movement of TuMV. lnterestingly, virus-induced gene silencing showed that sustained movement relied on myosin Xl-2, but not on myosin Vllls and XI-F. We propose that intercellular TuMV movement requires a progressive viral complex maturation along the secretory pathway where post-Golgi trafficking and the actomyosin network are important for proper PD targeting and delivery into neighbouring cells.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Laliberté, Jean-François
Mots-clés libres: potyvirus ; tumv
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 06 nov. 2015 16:36
Dernière modification: 09 nov. 2015 20:01
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2354

Actions (Identification requise)

Modifier la notice Modifier la notice