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Sécrétion de la xylanase C par le système TAT chez Streptomyces lividans.

Faury, Damien (2003). Sécrétion de la xylanase C par le système TAT chez Streptomyces lividans. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 213 p.

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Résumé

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Les Strepomycètes sont des bactéries Gram positives produisant de nombreuses protéines extracellulaires en grande quantité. Les travaux antérieurs menés sur la sécrétion des protéines chez Streptomyces lividans ont uniquement porté sur le système de sécrétion général ou GSP (General Secretory Pathway) qui sécrète des protéines non repliées. La protéine qui est exportée par ce système est synthétisée sous la forme d'un précurseur formé de la protéine mature allongée à son extrémité N-terminale d'une séquence plus ou moins longue appelée peptide signal. Ce dernier est clivé lors du processus de maturation du précurseur et permet de libérer dans le milieu extracellulaire la protéine mature. Récemment, un nouveau système de sécrétion a été mis en évidence chez les bactéries. Le précurseur des protéines qui emprunte ce système contient un peptide signal caractéristique contenant la séquence signature consensus 8/T-R-R-X-F-L-K. Du fait de la présence d'un doublet d'arginine, cette nouvelle voie de sécrétion porte le nom de système TAT pour « Twin Arginine Translocation ». Le système TAT se différencie du système GSP par sa capacité à sécréter des protéines déjà repliées. Le peptide signal de la xylanase C (XlnC) de S. lividans contient la séquence 8-R-R-G-F­ L-G qui ressemble à la séquence consensus TAT, ce qui laisse supposer que la XlnC est probablement sécrétée par le système TAT. Comme S. lividans produit de très faibles quantités de XlnC comparativement aux xylanases A et B, la production de XlnC devait être améliorée avant de pouvoir étudier en détails sa sécrétion. Ainsi, le remplacement du promoteur du gène xlnC par celui du gène x/nA augmente de 3 fois la production de XlnC. Cette construction servira de base pour la présente étude. L'étude de la sécrétion de la XlnC se fait par la technique du « pulse-chase » qui permet de suivre la maturation du précurseur en protéine mature. Le précurseur de la XlnC a une demi-vie d'environ 15 min et sa maturation semble sensible au carbonyl cyanamide m­ chlorophénylhydrazone (CCCP) mais pas à l'azoture de sodium (NaN3) ce qui est typique du système de sécrétion TAT. L'introduction de mutations au niveau du doublet d'arginine spécifique du système TAT n'abolit pas complètement la sécrétion de la XlnC mais s'accompagne d'une forte dégradation cytoplasmique du précurseur. La présence du doublet d'arginine est donc importante pour la sécrétion de la XlnC. La fusion de la XlnC avec un peptide signal de type GSP comme celui de la XlnA ne permet pas la sécrétion de la XlnC ce qui démontre que cette dernière est exclusivement sécrétée par le système TAT. Généralement, l'extrémité N-terminale des peptides signaux de type TAT est plus longue que celle des peptides signaux de type GSP. Afin de mieux comprendre le rôle de cette région, des délétions ont été effectuées dans la région-n du peptide signal de la XlnC. La délétion des 15 premiers acides aminés du peptide signal affecte faiblement la production d'enzyme. Par contre, la délétion des 20 premiers a.a. abolit la sécrétion de la XlnC. Il faut au moins 5 a.a. précédant la signature TAT pour permettre au peptide signal d'être encore fonctionnel. La région-n possède 4 a.a. chargés qui ont été remplacés par des a.a. non chargés afin d'en évaluer l'importance. L'annulation des charges permet d'augmenter la production de XlnC. Une production record de l'ordre de 100 UI.mr-1 est atteinte lorsque les deux charges négatives sont supprimées. Cependant, le rôle des charges de la région-n reste encore obscur. La région-c d'un peptide signal de type GSP contient une séquence A-X-A relativement bien conservée reconnue spécifiquement par une signal peptidase membranaire. Le peptide signal de la XlnC contient la séquence AHA. La modification du site de clivage n'entraîne qu'une légère baisse de production alors qu'elle inhibe la sécrétion des protéines dépendant du système GSP. Ceci suggère que la signal peptidase du système TAT ait une moins grande spécificité que celle du système GSP. Comme la XlnB2 possède 75% d'identité avec la XlnC, il était intéressant de voir si cette protéine normalement sécrétée par le système GSP pouvait l'être par le système TAT. Effectivement, lorsque le peptide signal de la XlnB2 est remplacé par celui de la XlnC, la XlnB2 se comporte comme la XlnC. De plus, les mutations introduites au niveau des charges du peptide signal de la XlnC ont le même effet sur la production de XlnB2 que sur celle de la XlnC. Cependant, lorsque le peptide signal de la XlnC est délété de ses 20 premiers a.a., la XlnB2 semble à nouveau se rediriger vers le système GSP.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Morosoli, Rolf
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: tat ; secretion ; xylanase ; streptomyce ; enzyme ; cellulase
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 13 mai 2014 18:38
Dernière modification: 18 déc. 2015 17:08
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/2119

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