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Étude de la relation structure/fonction de la protéine MntH d'Escherichia coli

Courville, Pascal (2008). Étude de la relation structure/fonction de la protéine MntH d'Escherichia coli Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 153 p.

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Résumé

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Le fer et le manganèse sont deux métaux de transition essentiels pour la plupart des organismes cellulaires, servant principalement de cofacteurs à de multiples enzymes. Cependant, l'accumulation excessive de ces métaux peut engendrer différentes réactions cytotoxiques. Dans les cellules eucaryotes, les protéines Nramp ou Slc Il ("natural resistance-macrophage protein ou Solute carrier family Il") servent de perméases aux cations divalents comme le Fe2+ et le Mn2+. Cette famille de pem1éases est également présente chez les bactéries. Chez les mammifères, les homologues Nramp 1 et 2 sont impliqués dans la défense contre différents pathogènes intracellulaires et dans l'homéostasie du fer, respectivement. La caractérisation moléculaire de ces perméases représente un défi de taille de par leur nature intégralement membranaire. Très peu de données sont connues à ce jour concernant leur structure en relation avec leur fonction. Les homologues procaryotes se nomment MntH (transporteur de manganèse dépendant du proton (H+)). Des analyses phylogénétiques détaillées ont permis de distinguer trois groupes de séquences bactériennes, MntH A, 8 et C, le dernier étant subdivisé en sous­ groupes Ca, cp et Cy. Dans le cadre de ce doctorat, nous avons décidé d'étudier des résidus transmembranaires pouvant jouer un rôle critique dans le mécanisme d'action des protéines Nramp/Mntl-1. Nous utilisons la protéine Mntl-1 d'E. coli (EcoliA) comme modèle car son activité est semblable aux homologues Nramp et sa topologie transmembranaire est établie. De plus, nous avons démontré pour la première fois le symport Me2+/H+ in vivo via un homologue bactérien appartenant à la famille Nramp. Les résidus clés ont été identifiés à l'aide d'une approche phylogénétique qui consiste à prédire les sites de divergence fonctionnelle en comparant différents groupes de séquences alignées d'homologues (outgroup et famille Nramp/MntH). Cinq sites permettent de discriminer les homologues de la famille Nramp des protéines appartenant à l'outgroup (correspondant aux résidus d'EcoliA: 034, N37, H2ll, N250 et N401). Chacun des résidus a été remplacé par celui présent dans l'outgroup et par d'autres résidus aux propriétés à priori dites plus conservatives. L'étude du mécanisme d'action d'EcoliA a été effectuée avec des préparations membranaires dans lesquelles la protéine est soit dans son orientation native (RSO-Right-Side-Out), soit inversée (ISO-lnside­ Out). Dans ces deux préparations, EcoliA a démontré un niveau d'activité différent vis-à­ vis du transport de Cd 2+. Nous avons choisi d'utiliser le Cd comme substrat car il s'agit d'un substrat universel de la famille Nramp, et parce qu'il induit une forte accumulation de H+ via EcoliA. Ces préparations membranaires ont également servi pour analyser la localisation transmembranaire des sites étudiés et préalablement substitués par une cystéine dans EcoliA. À l'aide de ces différentes techniques, nous avons démontré que les 5 résidus discriminant la famille Nramp/Mntl-1 sont tous impliqués dans le mécanisme d'action, en affectant soit le transport du Cd21 , du I-lou le changement de conformation. La caractérisation de Mntl-1 dans des vésicules RSO démontre que le CaCh favorise l'accumulation du Cd2+. De plus, le rôle respectif et l'accessibilité des résidus correspondant à des sites de divergence de type Il entre l'outgroup et la famille Nramp, sont en accord avec le modèle topologique existant et avec la structure tridimensionelle prédite pour EcoliA, basée sur une homologie possible avec la famille de la protéine LeuT ("Leucine transporter"), dénommé "Neurotransmitter: sodium symporter".

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Cellier, Mathieu
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: manganese ; fer ; transport ; nramp ; couplage ; proteinique ; slc
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 26 sept. 2013 13:59
Dernière modification: 08 déc. 2015 14:54
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/175

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