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Production économique d'enzymes ligninolytiques par fermentation à l'état solide des déchets agroindustriels et leurs applications.

Gassara, Fatma (2012). Production économique d'enzymes ligninolytiques par fermentation à l'état solide des déchets agroindustriels et leurs applications. Thèse. Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en sciences de l'eau, 317 p.

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Résumé

Les champignons responsables de la pourriture blanche du bois sont capables de synthétiser des enzymes extracellulaires dégradant des produits chimiques insolubles, comme la lignine et plusieurs polluants toxiques très persistants dans l'environnement. Cependant, la production d'enzymes reste très couteuse en raison du coût élevé de la matière première, qui représente entre 40% et 60% du coût de production. Dans cette perspective, cette étude vise l'utilisation des déchets comme matière première pour la production d'enzymes. Ces matières premières ont été choisies comme substrats de croissance pour la production d'enzymes en raison de leur présence en très grande quantité, leur haute biodégradabilité, leur richesse en carbone et leur élimination de ses propres effets néfastes sur l'environnement. Cette étude porte sur la production d'enzymes ligninolytiques en se basant sur une fermentation à l'état solide de différents déchets agro-industriels. Quatre déchets ont été testés (les résidus de poisson, les déchets de microbrasserie, les déchets de l'industrie de jus de pomme et les rejets de l'industrie de pate et papier) afin de cibler le déchet permettant une meilleure croissance du microorganisme (Phanerocheate chrysosporium) et une meilleure production des enzymes ligninolytiques. L'utilisation des déchets comme matière première a permis de résoudre le problème du coût élevé de la matière première (40-60% du coût de production). Après criblage des déchets, une optimisation des conditions de fermentation (humidité, concentration de veratryl alcool et de sulfate de cuivre) dans les fioles a été réalisée en se basant sur la méthodologie de surface de réponse. Une modification de la méthode de quantification de la lignine (remplacer l'étape d'acidolyse par reflux utilisée dans la méthode de Klason par la digestion par micro-onde) a été réalisée afin de quantifier la lignine plus rapidement et efficacement. Après l'optimisation des conditions de fermentation en fioles, des expériences de fermentation à grande échelle (12 L) ont étés réalisées, tout en optimisant l'agitation et l'aération dans le fermenteur. En outre, une fermentation en culture liquide en utilisant la même souche a été faite afin de comparer la production des enzymes en culture liquide avec celle en culture solide. Puis, les enzymes ont été extraites puis formulées en microcapsules. L'extrait libre et les enzymes formulées ont été par la suite testés dans la dégradation d'une eau fortifiée avec un contaminant émergeant, bisphénol A (SPA) et dans la clarification des jus. Une évaluation de l'impact environnemental et économique du procédé de production des enzymes ligninolytiques par fermentation des déchets solides de jus de pomme a été finalement réalisée. Les résultats de cette étude ont montré en premier lieu que les déchets de jus de pomme (apple pomace) et les déchets de microbrasserie (bewery spent grain) sont des excellentes matières premières pour la production des enzymes ligninolytiques. De plus, il a été confirmé que l'addition des inducteurs (veratryl alcool, sulfate de cuivre) dans le milieu de culture a amélioré la production des enzymes ligninolytiques et accélère la croissance de P. chrysosporium. D'après la méthodologie de surface de réponse RSM, les valeurs optimales de MnP, LiP et le Log 10 de la viabilité of P.chrysosporium dans AP ont été obtenues avec 80 % d'humidité, 3 mmole/kg VA et 0.5 mmole/kg de sulfate de cuivre. Néanmoins, la production maximale de LiP dans les déchets de microbrasserie a été obtenue avec 70 % d'humidité, 2 mmole/kg de VA et 1 mmole/kg de sulfate de cuivre. De même, la production maximale de laccase dans apple pomace et les déchets de microbrasserie a été obtenue avec 80 % (p/p) d'humidité, 3 mmole/kg de VA et 1.5 mmole/kg de sulfate de cuivre. Aussi, il a été montré que les meilleures conditions de digestion par microonde obtenues se présentent de la façon suivante : pression = 30 bar, température = 170 °C, temps = 15 min. L'emploi de la micro-onde a réduit considérablement le temps nécessaire pour quantifier la lignine dans les déchets et a amélioré la précision de la méthode de Klason. En second lieu, les résultats de la fermentation d'apple pomace dans un fermenteur de 12 ont montré que la production d'enzymes a été fortement influencée par le débit d'aération et le mode d'agitation. Les productions maximales de MnP (1690,3 ± 87,6), LiP (387,9 ± 14,3) et de la laccase (898,9 ± 53,3 U /gss) ont été obtenues en utilisant 1,66 VVM comme débit d'air et une agitation continue pendant la phase de latence, discontinue pendant la phase exponentielle et continue pendant la phase stationnaire de croissance. En outre, les activités maximales de MnP, LiP et laccase, obtenues par fermentation en culture liquide de la boue d'ultrafiltration (220 U / L, 6,5 U / L, 45 U / L) ont été de l'ordre de 10 000 , 40 000 et 6000 fois plus faibles que les activités obtenues dans une culture de déchets solide de jus de pomme. En troisième lieu, la formulation des enzymes dans trois structures d'hydrogel à savoir les réseaux semi-interpénétrés de poly (acrylamide) / gélatine (P (AAM) / Gel), poly (acrylamide) / pectine (P (AAM) / Pec) et poly (acrylamide)/ CMC (P (AAM) / CMC) a augmenté considérablement la stabilité thermique des enzymes ligninolytiques et a empêché de leur inactivation. En quatrième lieu, il a été prouvé que le traitement du jus de grenade et des fruits rouges par des enzymes ligninolytiques encapsulées, a abouti à une réduction des composés polyphénoliques (plus de 60% dans tous les traitements) et à une amélioration de la clarté plus significatives (p> 0,05) que celles obtenues par le traitement par des enzymes libres (45%). Il a été aussi démontré qu'une forte dégradation de BPA (diminution de 90% de la concentration initiale) a été obtenue après 8 h de traitement d'eau fortifié par BPA (10 ppm) par des enzymes ligninolytiques encapsulées dans un hydrogel de polyacrylamide et pectine. Par contre, la dégradation du bisphénol A par les enzymes libres (diminution de 26% de la concentration initiale) était inférieure à celle obtenue par des enzymes encapsulées. Par la suite, l'encapsulation des enzymes a permis l'amélioration de la stabilité thermique des enzymes et l'augmentation de leurs activités dans la bioremédiation et la clarification des jus. En dernier lieu, une comparaison des émissions de gaz à effet de serre durant la fermentation des déchets solides de jus de pomme avec celles générés par d'autres types de gestion (l'incinération, l'enfouissement, alimentation animale et compostage) a été étudiée. Les résultats trouvés dans cette étude ont montré que la production d'enzymes est un procédé moins polluant pour l'environnement en termes de rejet de GES (906,81 tonnes de CO₂ éq par année). En comparaison, l'enfouissement a été trouvé comme le procédé le plus polluant (1841 tonnes de CO₂ éq par année). Ces résultats incitent l'utilisation des déchets solides de jus de pomme dans la production d'enzymes, afin de respecter l'environnement et diminuer la production de gaz participant au réchauffement de la planète. Enfin, il a été prouvé que l'utilisation des déchets solides de jus de pomme comme substrat de fermentation, réduit le coût de production des enzymes ligninolytiques de 32,30 % par rapport à celui trouvé en utilisant le milieu synthétique (son de blé) comme milieu de culture. Ce projet de recherche a contribué à apporter une solution à la problématique de gestion des déchets agroindustriels et faire d'eux une matière première pour la production des enzymes ligninolytiques. Il a permis donc la préparation d'un produit formulé à valeur ajoutée d'enzymes ligninolytiques qui pourra être utilisé dans la dégradation des contaminants émergeants comme le BPA et la clarification des jus de fruits.

Abstract

White rot fungi are one group of fungi that produces a family of enzymes called ligninolytic enzymes which possess extensive biodegradation properties. These enzymes are able to degrade several persistent toxic pollutants in the environment and these enzymes have been employed fro their decontamination. However, enzyme production is very expensive due to the high cost of raw material, which represents 40-60% of the cost of production. In this perspective, this study aims to use solid and liquid wastea as substratea for the production of ligninolytic enzymes. Agro-industrial wastes were chosen as growth medium due to their omnipresence, high biodegradability, and richness in carbon which if left as such would lead to disposal problems and hence adverse environmental impacts. This study comprised solid-state fermentation (SSF) to test the production of lignocellulosic enzymes, namely lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase by Phanerochaete Chrysosporium using different agro-industrial wastes, such as fishery residues, municipal dewatered sludge, brewery waste, apple waste (pomace) and pulp and paper industry sludge. The use of waste as raw material has solved the problem of high cost of raw material(40-60% of production costs). After the screening of substrates, an optimization of fermentation conditions (moisture, concentration of veratryl alcohol and copper sulphate) in flasks was performed based on the response surface methodology. The influence of microwave heating during the mild acidolysis step to replace traditional refluxing in order to quantify lignin by Klason method was also investigated to arrive at a simple and rapid analysis method. The enzyme production process was then scaled up in 12 L fermentor, while optimizing the agitation and aeration conditions. In addition, liquid culture fermentation using the same strain was carried out to compare the production of enzymes in liquid culture with that in solid culture. Later, enzymes were extracted and formulated into microcapsules. Free extract and encapsulated enzymes were tested in the degradation of an emerging contaminant bisphenol A (BPA) and for the clarification of juice. An assessment of the environmental and economic impact of the production process of ligninolytic enzymes by solid state fermentation of apple pomace was alos carried out. The results of this study have shown that apple pomace and brewery waste are excellent raw materials for the production of ligninolytic enzymes. Moreover, it was found that the addition of inducers (veratryl alcohol, copper sulfate) in the culture enhanced the production of ligninolytic enzymes and accelerated the growth of P. chrysosporium. According to the response surface methodology, higher values of manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP) and viability of P. chrysosporium on apple pomace (1287.5 U MnP/gds (units/gram dry substrate), 305 U LiP/gds, and 10.38 Log 10 viability) and brewery waste (792 U MnP/gds and 9.83 Log 10 viability) were obtained with 80% moisture, 3 mmol/kg VA, and 0.5 mmol/kg copper. LiP production in brewery waste (7.87 U/gds) was maximal at 70% moisture, 2 mmol/kg VA, and 1 mmol/kg copper. Higher production of laccase in apple pomace (789 U/gds) and brewery waste (841 U/gds) were obtained with 80% moisture, 3 mmol/kg VA, and 1.5 mmol/kg copper. Likewise, the best conditions for microwave digestion to extra ct lignin were obtained as: Pressure = 30 bar, temperature = 170 ° C, time = 15 min. The use of microwave has significantly reduced the time needed to quantify the lignin in waste and improved the precision of the Klason method. The results of solid state fermentation in 12 L fermenter showed that enzyme production was strongly influenced by the aeration rate and mode of agitation. The maximum production of MnP (1690.3 ± 87.6), LiP (387.9 ± 14.3) and laccase (898.9 ± 53.3 U / gss) were obtained using 1.66 VVM as air flow and continuous agitation during the lag phase, discontinuous during the exponential phase and continuous during the stationary phase of growth. In addition, the maximal activities of laccase (220 U/L), LiP (6.5 U/L) and laccase (45 U/L) in liquid culture were 10000, 40000 and 6000 -folds lower than the activities obtained in solid culture of apple pomace waste, respectively. The formulation of the three enzymes in hydrogel structures, namely semi-interpenetrating networks of poly (acrylamide) / gelatin (P (MAA) / Gel), poly (acrylamide) / pectin (P (AAM) / Pec) and poly (acrylamide) / CMC (P (AAM) / CMC) significantly increased the thermal stability of ligninolytic enzymes and prevented their inactivation. It was also seen that the polyphenolic compound reduction and clarity amelioration in berry pomegrante juice using encapsulated enzymes treatment (more than 60% in ail treatment) was highly significant (p> 0.05) as compared to free enzymes used for the treatment (45 %). Hence, ligninolytic enzymes (LiP, MnP and laccase) were able to clarify the juice and this method can replace the traditional ultrafiltration method in order to make the clarification process more economical for the industries. It was shown that higher degradation of SPA (90 % of initial concentration of 10 ppm) by ligninolytic enzymes encapsulated on polyacrylamide hydrogel and pectin after 8 hour of contact time. The degradation of Bisphenol A with free enzyme (26%) was lower when compared with encapsulated enzymes. Thus, the encapsulation of enzymes has allowed the improvement of thermal stability of enzymes and increased their activities in bioremediation and the juice clarification of juice. Finally, greenhouse gas (GHG) emission analysis of apple pomace management strategies, namely incineration, landfill, composting, solid-state fermentation to produce high-value enzymes and animal feed, using life cycle assessment (LCA) model was performed. The GHG analysis indicated that, among ail the apple pomace management sub-models for a functional unit, solid-state fermentation to produce enzymes was one from the more effective method for reducing GHG emissions and carbon credit (906.81 tons C02 eq. per year, 27204 $ of carbon credit taking into consideration an assumption of $30/ton of C02 equivalent), while apple pomace landfill resulted in higher GHG emissions (1841.00 tons C02 eq. per year, 55230 $ of carbon credit). These results showed that solid-state fermentation gave positive indications of environmental sustainability for the use of this strategy to manage apple pomace and other agricultural wastes, particularly in Quebec and also extended to other countries. Finally, it was shown that the use of apple pomace as raw material reduced the cost of ligninolytic enzymes production of 32.30% compared with the synthetic medium (wheat bran). In this project, an interesting observation that was made was the higher production of valuables compounds, namely ligninolytic enzymes by the solid state fermentation of pomace which is otherwise composted or used as animal feed. Moreover, this work is novel in the sense that there is integrated management of pomace wastes through production of ligninolytic enzymes that was used in the degradation of emerging contaminants, such as SPA and clarification of fruit juices, important applications in the field of bioremediation and juice manufacture.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Brar, Satinder Kaur
Co-directeurs de mémoire/thèse: Tyagi, Rajeshwar D.
Mots-clés libres: enzymes ligninolytique; déchets agro-industriels; inducteurs; Phanerochaete chrysosporium; fermentation
Centre: Centre Eau Terre Environnement
Date de dépôt: 07 oct. 2013 19:13
Dernière modification: 18 nov. 2015 19:55
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/1545

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