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Le virus de la mosaïque du navet (TuMV) comme vecteur pour l’expression de protéines hétérodimériques.

Bougie, Véronique (2004). Le virus de la mosaïque du navet (TuMV) comme vecteur pour l’expression de protéines hétérodimériques. Mémoire. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 150 p.

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Résumé

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Il est maintenant possible de convertir les plantes en usines naturelles de médicaments ou autres molécules à hautes valeurs ajoutées. L'agriculture moléculaire, ou moléculture, répond ainsi à une demande pressante. La variable critique pour la viabilité économique de cette approche est la rapidité avec laquelle une forte concentration de protéines d'intérêt est atteinte dans la plante. En combinant la capacité réplicative des virus et l'intégration stable d'un transgène dans la plante, il sera possible d'amplifier de manière très significative et ce, rapidement, la quantité de protéines estimées produites au moment de la récolte. Le virus de la mosaYque du navet (TuMV) est membre du grand groupe des Potyvirus. Son génome est constitué d'une molécule d'ARN simple brin de polarité positive longue de 10 000 nucléotides. Le TuMV code pour une polyprotéine unique qui est clivée en 10 protéines matures par trois protéinases virales. Les caractéristiques importantes du TuMV qui en font un candidat de choix pour le développement d'un vecteur d'expression sont premièrement, qu'une protéine d'intérêt qui ferait partie de la polyprotéine serait synthétisée au même niveau que les autres protéines virales; deuxièmement, la forme filamenteuse du virus offre la possibilité d'introduire plus d'un gène étranger dans le même vecteur. En utilisant une copie ADN du génome viral cloné sous le contrôle d'un promoteur constitutif, notre équipe a pu réaliser deux premières constructions contenant soit le gène rapporteur gfp ou uidA inséré entre les gènes codant pour les protéines P1 et HC-Pro du TuMV. Malgré que la libération de ces protéines de la polyprotéine virale générait la présence d'acides aminés supplémentaires aux extrémités, les résultats des tests in planta ont révélé la production de GFP et de GUS fonctionnels. Les objectifs de nos travaux visent donc à : 1) déterminer la possibilité d'exploiter un second site d'insertion, et 2) d'élaborer une stratégie nouvelle d'insertion qui permettrait la production de protéines aux extrémités carboxy­ terminales non-modifiées. Ainsi dans un premier temps, les gènes gfp ou uidA ont été insérés entre les gènes codant pour les protéines Pol et CP du virus. Des essais transitoires furent réalisés sur des plants de Brassica par la technique de biolistique. L'observation aux ultraviolets et des tests histochimiques ont révélés la présence in vivo des protéines GFP et GUS fonctionnelles. Des immunobuvardages de type western et des analyses par RT-PCR ont montré la bonne expression de chacune des protéines insérées et que la stabilité transcriptionnelle semble influencée par la taille, la nature et/ou la position du gène étranger. Suite à ces résultats, nous avons donc dans un deuxième temps tenté l'expression simultanée des deux gènes rapporteurs insérés dans une même construction. La maintenance du caractère infectieux du vecteur et l'expression efficace des gènes introduits nous ont ensuite mené a tester la production d'anticorps par l'intermédiaire de notre vecteur. Finalement, des délétions furent réalisées par PCR au niveau de la capside virale. Ces mutations avaient pour but d'identifier les séquences cis nécessaires à la réplication du TuMV. Les constructions ADN délétées furent transfectées sur des protoplastes de Nicotiana benthamiana. Les résultats préliminaires ont semblé démontrer la possibilité d'éliminer la séquence codante entre le 3e et le 263e codon de la capside tout en conservant une capacité de réplication plus qu'intéressante pour les besoins encourus.

Type de document: Mémoire
Directeur de mémoire/thèse: Laliberté, Jean-François
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: virus ; mosaique ; navet ; proteine ; heterodimerique
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 26 sept. 2013 14:38
Dernière modification: 14 déc. 2015 19:57
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/1486

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