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Études des déshalogénases réductrices de Desulfitobacterium hafniense PCP-1

Bisaillon, Ariane (2010). Études des déshalogénases réductrices de Desulfitobacterium hafniense PCP-1 Thèse. Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 145 p.

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Résumé

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Plusieurs composés halogénés, tel que le pentachlorophénol (PCP), sont des polluants persistants dans l'environnement qui ont entraîné la contamination des sols et des eaux de nombreux sites. Les microorganismes anaérobies offrent des possibilités intéressantes pour la biorestauration des sites contaminés; il importe donc de pousser plus loin leur caractérisation. Desulfitobacterium hafniense PCP-1 est la seule bactérie anaérobie connue pouvant déshalogéner le PCP en 3-chlorophénol (3-CP) et d'autres molécules aromatiques en positions ortho, meta et para ainsi que le tétrachloroéthène (PCE). Deux déshalogénases réductrices ont déjà été purifiées et caractérisées. Une première (CrdA) induite par le 2,4,6- trichlorophénol (2,4,6-TCP) peut déshalogéner principalement en position ortho. Une autre (CprA5) induite par le 3,5-dichlorophénol (3,5-DCP) peut déshalogéner principalement en positions meta et para. Ce projet de recherche a permis dans un premier temps de réaliser la purification partielle d'une nouvelle déshalogénase de type CprA effectuant la déshalogénation du PCP d'une culture de D. hafniense PCP-1 induite avec du 2,4,6-TCP. La purification de l'enzyme a été réalisée en solubilisant les protéines de la membrane avec du Triton X-100 3% suivie d'une première chromatographie sur colonne échangeuse ionique DEAE-5PW à pH 6,5 et d'une deuxième chromatographie sur colonne d'interaction hydrophobe HiTrap Butyl HP. Après l'analyse SDS-PAGE de la préparation enzymatique, nous avons observé 2 bandes de protéines. L'analyse de ces bandes par spectrométrie de masse a permis de relier une protéine de 47 kDa au gène cprA3 dans le génome de D. hafniense DCB-2. La séquence en acides aminés contient un peptide signal TAT ainsi que deux motifs conservés pour la liaison d'un centre fer-soufre. L'équivalent du gène cprA3 chez la souche PCP-1 a été séquencé. Sa séquence est identique à celle du gène de la souche DCB-2. L'enzyme CprA3 est souvent copurifiée avec une sous-unité d'une NADH-quinone oxydoréductase. La stabilité de la CprA3 semi-purifiée est très faible. Nous avons observé des pertes importantes de plus de 90% de son activité après 4 h à 4 oc et de 95% après 24 h. La caractérisation de la CprA3 a montré que l'enzyme est sensible à l'oxygène. Elle a une température optimale se situant entre 50-55 °C, un pH optimal de 7,0 et elle est inhibée par le sulfite mais non par le sulfate. Des essais d'inhibition réversible en présence de lumière par le 1-iodopropane de l 'activité de déshalogénation du PCP suggèrent 1'implication d'un cobalamine dans 1'activité enzymatique. La déshalogénation du PCP et d'autres chlorophénols est effectuée en position ortho. La valeur de la Km apparente de l'enzyme pour le PCP en présence de méthyl viologène 2 mM a été évaluée à 46,7 JlM. Dans un deuxième temps, l'expression des gènes cprA2-5 de D. haji1iense PCP-1 a été étudiée par RT-PCR en temps réel. Les effets de différents chlorophénols par rapport au temps d'incubation, de leur concentration et de la température d'incubation de la culture sur l'expression de ces gènes ont été évalués. L'expression du gène cprA3 est fortement induite 4 h suivant 1'ajout de 2,4,6-TCP à 50 flM et celle du gène cprA5 après 18 h, lorsque la concentration de 2,4-DCP est élevée. L'expression du gène cprA5 est fortement induite 4 h suivant l'ajout de 3,5-DCP à 60 flM. Le PCP à 30 flM induit la transcription des gènes cprA2 et cprA3. L'expression du gène cprA4 n'est pas induite par le 2,4,6-TCP ni le 3,5-DCP et faiblement induite par le PCP. L'expression des gènes cprA3 et cprA5 est fortement induite par le 2,4,6-TCP à 0,125 flM et le 3,5-DCP à 0,15 uM respectivement et le niveau d'expression est maximal à 37°C. Dans son ensemble, cette étude a apporté une meilleure compréhension des facteurs influents sur l'activité de déshalogénation et a permis de mieux évaluer le potentiel de dégradation de D. hafniense PCP-1. Les résultats obtenus pourraient servir à l'élaboration de biotraitements anaérobies plus efficaces ou à faciliter la purification de nouvelles déshalogénases réductrices.

Type de document: Thèse
Directeur de mémoire/thèse: Beaudet, Réjean
Co-directeurs de mémoire/thèse: Villemur, Richard
Informations complémentaires: Résumé avec symboles
Mots-clés libres: bacterie ; anaerobie
Centre: Centre INRS-Institut Armand Frappier
Date de dépôt: 11 nov. 2015 15:07
Dernière modification: 11 nov. 2015 15:07
URI: http://espace.inrs.ca/id/eprint/142

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